Caracterización de glicoproteínas y colesterol de los microdominios de la membrana de espermatozoides de cerdo durante la capacitación y criopreservación Público Deposited
The surface of the spermatozoa is coated with glycoproteins, the redistribution of which during in vitro capacitation plays a vital role in the subsequent fertilization process. Lipid rafts are membrane microdomains involved in signal transduction through receptors and include or recruit specific types of proteins and glycoproteins. Few studies have focused on identifying glycoproteins resident in the lipid rafts of spermatozoa. Proteins associated with lipid rafts modify their localization during capacitation. The study's objective was to identify the glycoproteins associated with lipid rafts of capacitated boar spermatozoa through a lectin-binding assay coupled to a mass spectrometry approach. From the proteomic profiles generated by the raft proteins extractions, we observed that some bands' intensity increased after capacitation while others' decreased. To determine whether the proteins obtained from lipid rafts are glycosylated, lectin blot assays were performed, the protein bands with good resolution and significant glycosylation modifications after capacitation were analyzed by mass spectrometry. The bands of interest had an apparent molecular weight of 64, 45, 36, 34, 24, 18, and 15 kDa. We sequenced the seven bands, and 20 known or potential glycoproteins were identified. In our knowledge, this is the first time that the following proteins and their association with sperm lipid rafts are described: ADAM5, SPMI, SPACA1, Seminal plasma protein pB1, PSP-I, MFGE8, tACE, PGK2, SUCLA2, and MDH1. Moreover, LYDP4, SPAM-1, HSP60, ZPBP1, and AK1 were previously reported in mouse and human spermatozoa lipid rafts but not in boar spermatozoa. We also found and confirmed the presence of ACR, ACRBP, AWN, AQN3, and PRDX5 in lipid rafts of boar spermatozoa. This paper provides an overview of the glycosylation pattern in lipid rafts of boar spermatozoa before and after capacitation. The further glycomic analysis is needed to determine the type and the variation of glycan chains of the lipid rafts glycoproteins on the surface of spermatozoa during capacitation and acrosome reaction. Five patterns of cholesterol distribution of the rafts were found in non- capacitated sperm: Pattern A with fluorescence in the flagellum and head region predominated; after capacitation, it was pattern C with fluorescence in the head, in cryopreserved two patterns were observed more being the majority patterns A and C. Regarding the concentration of cholesterol, it was found that in cryopreserved sperm there was considerable loss of cholesterol which was detected in the freezing medium, so it is postulated that the freezing process affected the sperm membrane considerably.
La superficie de los espermatozoides está recubierta de glicoproteínas cuya redistribución durante la capacitación in vitro juega un papel clave en el proceso de fertilización. Las balsas lipídicas o rafts son microdominios de membrana involucrados en la transducción de señales a través de receptores e incluyen o reclutan tipos específicos de proteínas y glicoproteínas. Pocos estudios se han centrado en identificar glucoproteínas residentes en las balsas lipídicas de los espermatozoides. Las proteínas asociadas con las balsas lipídicas modifican su localización durante la capacitación. El objetivo de este estudio fue identificar las glicoproteínas asociadas con las balsas lipídicas de los espermatozoides de cerdo capacitados, mediante técnicas de electroforesis, Western blot, lectinas y espectrometría de masas. A partir de los perfiles proteómicos generados por las extracciones de proteínas de balsas lipídicas, observamos que después de la capacitación, la intensidad de algunas bandas aumentó mientras que la de otras disminuyó. Para determinar si las proteínas obtenidas de las balsas lipídicas están glicosiladas, se realizaron ensayos de Western blot con lectinas. Se analizaron por espectrometría de masas bandas de proteínas con buena resolución y que mostraban modificaciones significativas de glicosilación después de la capacitación. Las bandas de interés tuvieron un peso molecular aparente de 64, 45, 36, 34, 24, 18 y 15 kDa. Se secuenciaron las 7 bandas y se identificaron 20 glicoproteínas conocidas o potenciales. Diez de estas proteínas se describen en este estudio por primera vez como proteínas asociadas con balsas lipídicas de espermatozoides (ADAM5, SPMI, SPACA1, proteína plasmática seminal pB1, PSP-I, MFGE8, tACE, PGK2, SUCLA2, MDH1). Además, LYDP4, SPAM-1 HSP60, ZPBP1, AK1 se reportaron previamente en balsas lipídicas de espermatozoides de ratón y humanos, pero no en espermatozoides de cerdo. También encontramos y confirmamos la presencia de ACR, ACRBP, AWN, AQN3 y PRDX5 en balsas lipídicas de espermatozoides de cerdo. Se describió el patrón de glicosilación en balsas lipídicas de espermatozoides de cerdo antes y después de la capacitación. Se necesitan más análisis glicómicos para determinar el tipo y la variación de las cadenas de glicanos de las glicoproteínas de las balsas lipídicas en la superficie de los espermatozoides durante la capacitación y la reacción acrosomal. Se encontraron 5 patrones de distribución del colesterol de balsas lipídicas, en espermatozoides no capacitados predominó el patrón A con fluorescencia en la región del flagelo y cabeza, en los capacitados fue el patrón C con fluorescencia en la cabeza, en los criopreservados se observaron dos patrones más siendo los mayoritarios los patrones A y C. Respecto a la concentración de colesterol, se encontró que en los espermatozoide criopreservados hubo pérdida considerable del colesterol el cual se detectó en el medio de congelación por lo que se postula que el proceso de congelación afectó considerablemente la membrana de los espermatozoides.
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