Análisis del papel del gen rifP en la biosíntesis de rifamicina Pubblico Deposited
Los actinomicetos son un grupo de bacterias Gram positivas cuya importancia biotecnológica radica en su capacidad de producir un gran número de metabolitos secundarios, entre los que se encuentran los antibióticos. La rifamicina es un antibiótico producido por A. mediterranei cuya importancia farmacológica radica en tener actividad contra el microorganismo causante de la tuberculosis y otras micobacterias. Durante la segunda mitad del siglo pasado se incrementaron los estudios para el mejoramiento genético de actinomicetos con miras a incrementar los niveles de producción. Se identificaron una gran cantidad de genes involucrados en el metabolismo secundario de los actinomicetos. Dentro de ellos se han encontrado genes involucrados en la resistencia y exportación de los antibióticos propios de cada microorganismo productor. Sin embargo, se ha puesto poca atención el papel que juegan estos genes en la regulación de los niveles de producción. Pues puede presentarse un efecto tóxico propio de la actividad del antibiótico que sintetizan cuando las concentraciones del mismo son altas lo que marca un límite en la producción en cepas industriales de alta producción. En microorganismos eucariontes que producen antibióticos como Penicillium chrysogenum productor de penicilina, los antibióticos son concentrados en vesículas membranales internas que posteriormente son liberados al medio por exocitosis. Sin embargo los organismos procariontes no son capaces de formar tales vesículas, por lo que tienen que exportan el producto por un sistema de transporte de membrana. Se han identificado en muchos actinomicetos proteínas de membrana que funciona como una bomba exportadora de antibiótico. Tal es el caso de Streptomyces pristinaespiralis, productor de pristinamicina en quien el gen ptr codifica una proteína responsable de la exportación de dicho antibiótico mediante un sistema antiport, pristinamicina/protón. Por otro lado, en 1998 August et al. reportaron la secuencia de nucleótidos de los genes involucrados en la biosíntesis de rifamicina. Dentro del cluster, encontraron 34 marcos abiertos de lectura, uno de los cuales, denominado rifP presenta un 66.1% de homología con el gen ptr de Streptomyces pristinaespiralis, mientras que a nivel protéico RifP y Ptr tienen una similitud de 81.2%. Como se mencionó Ptr en S. pristinaespiralis actúa como una proteína transmembranal exportadora de pristinamicina, y con base en esta homología pensamos que el gen rifP codifique para una proteína que tenga la función de exportar la rifamicina. Para probar nuestra hipótesis, diseñamos un método de silenciamiento por ARN antisentido para inactivar la expresión del gen rifP. Para esto fue necesario la construcción de un vector plasmídico de expresión con replicación autónoma en A. mediterranei. El módulo de expresión rifPas se construyó en el plásmido pBluescript® utilizado el terminador del gen asd de Amycolatopsis lactamdurans (Tasd) y el promotor del gen de resistencia a eritromicina modificado (PermE*). El gen rifP fue amplificado por PCR a partir del ADN total de A. mediterranei S699, y clonado en el plásmido pGEM-T® (Promega). Posteriormente el gen rifP se subclonó en el sitio BamHI existente entre promotor y terminador. Se seleccionaron los vectores que contenían el gen rifP antisentido con respecto al promotor. El módulo de expresión (promotor, gen y terminador) fue subclonado a un vector de replicación autónoma de Amycolatopsis junto con el gen de resistencia a eritromicina como marcador de selección. El plásmido construido llamado pUAMAE5 contenía todos los elementos necesarios para silenciar al gen rifP. Utilizando este plásmido se transformó la cepa S699 de A. mediterranei mediante una técnica diseñada durante el desarrollo de esta tesis basada n la electroporación. La producción de rifamicina de la cepa transformante denominada A. mediterranei rifPas se comparó con la de la cepa parental S699 en condiciones de producción, encontrándose que el silenciamiento del gen rifP ocasiona una disminución de la producción de un 80 %.
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