Incorporación de tres antibióticos en nauplios, metanauplios, juveniles y adultos de Artemia franciscana (Kellog, 1906) para inhibir el crecimiento de la bacteria Aeromonas hydrophila Público Deposited
The worlwide expansion experienced by aquaculture in the last years has improved the culture techniques used to manage large densities of organisms in reduced spaces. This has induced, on one side, increased aquaculture production yields, but has also given rise to higher rates of diseases in cultured organisms, causing high mortality rates and economical losses (Alderman, 1988). The development of biotechnologies that use live feed as important carriers not only of enriching substances but also of prophylactic and therapeutic substances has been instrumental in eliminating or maintaining at their minimal pathogenic organisms, since medications are no longer lost in the water and the adequate dose can be administered according to each species and developmental phase. The crustacean Artemia has been used as a carrier agent of medications, mainly during its nauplius stage, due to its availability, easy handling, and adequate size, serving as food during the first life stages of aquaculture species (Castro et al., 2003). Besides, the use of other developmental stages, metanauplii, juveniles, and adults, of this crustacean has allowed treatment of diseases in juvenile, adult, even reproducer, organisms, avoiding horizontal and vertical transmission of pathogens, as well as the consequent economical loss caused by mortality due to viruses, bacteria, fungi, and other parasites affecting the organisms being cultured. This research was aimed at determining antibiotic incorporation during the different developmental stages, nauplius, metanauplius, juvenile, and adult, of Artemia to inhibit the pathogenic bacterium Aeromonas hydrophila, which appears in culture systems of fresh water fishes, and can produce morphological and physiological damage to the organisms, high mortalities and, consequently, economical losses to aquaculture farmers. The used antibiotics were chloramphenicol (base antibiotic), nitrofurantoin (Macrodantina®, caplets, 50 mg), and ciprofloxacin (Ciproflox®, caplets, 250 mg). For the bioessay with nauplii, 5,000 organims (10 org/mL) were placed in a precipitation flash with 500 mL water at 40 g/L salinity, temperature of 23 ± 2 °C, and constant aeration, this procedure was followed for each antibiotic. The anitibiotic was added to each flask, 4 h later the nauplii were filtered, washed with fresh water, and ground in a mortar. In Petri dishes containing TSBA medium and 1 mL of bacteria inoculation, four small wells were made, each one for each antibiotic and one for the witness; 1 mL of the ground nauplii was added to each well. Petri dishes were incubated for 24 h at 37 °C and the inhibition halos were measured. For the metanauplii (48 h from birth) bioassay, the same procedure as that used for nauplii was followed. For the bioassay with Artemia juveniles, 200 juvenile organisms (10-12 days from birth) were taken from the culture and placed in 1 L precipitation flasks with 500 mL of water at 40 g/L salinity, this wase made for each antibiotic. Organisms were kept 24 h without any food, then each antibiotic was added, and organisms were left in this solution for 4 h. Afterwards, organisms were washed with fresh waters and five groups of 5, 10, 15, 25, 50 individuals were formed and the witness. Each group was ground in a mortar. To determine the inhibition halo at this developmental stage, the same procedure used for nauplii and metanauplii was followed. For the adult stage (>15 days from birth) bioassays, the same incorporation procedure and determination of the antibiotic effect on the bacterium were followed as those used for juveniles. For results, first determined the calibration curve for each antibiotic, which was linear (R2 =0.9944 for chloramphenicol, R2 =0.9616 for ciprofloxacin, R2 =0.9721 for nitrorurantoin). The relation between each antibiotic concentration and the inhibition area is expresed by: Y=3.192X+5E-14 for chloramphenicol, Y=24.517X+2E-13 for ciprofloxacin, Y=0.2831X-6E-14 for nitrofurantoin. With these values, the concentration reached by each of the antibiotics incorporated in Artemia franciscana nauplii, metanauplii, juveniles, and adults was calculated. The extraction techniques to identify the presence of antibiotics yielded good results in water, digestive tract, and feces. In water, the supernatant presented inhibition halos, finding that chloramphenicol was the one with the largest halo diameter (13.75 ± 1.767 mm), reaching a 46.53 µg/mL concentration; in the precipitate, ciprofloxacin and nitrofurantoin gave inhibition halos of 18.55 mm (11.2 µg/mL ) and 18 mm (898.55 µg/mL), respectivily. In the digestive tract, the three antibiotics gave inhibition halos above 14 mm in diameter. Ciprofloxacin reached the highest value with 19.5 ± 0.71 mm, corresponding to 11.56 µg/mL concentration of the antibiotic. In faces, we found inhibition halo diameters above 20 mm with the three antibiotics; their concentrations were high in faces, reaching concentration of 287.87 µg/mL for chloramphenicol. The pH inside Artemia’s digestive tract posed no problem for the antibiotics. Regarding, the bioassays on antibiotics incorporation, it was determined that Artemia metanauplii, juveniles, and adults require 4 h for the filling of their digestive traces. In nauplii, the antibiotic with the largest inhibition halo was nitrofurantoin with an average value of 22.26 mm, corresponding to a 1,375.42 µg/mL concentration. The other two antibiotics presented inhibition halos barely above 10 mm. In metanauplii, the antibiotic with the largest inhibition halo was ciprofloxacin, with an average value of 22.57 mm (16.32 µg/mL), chloramphenicol with 15.4 mm (58.37 µg/mL); nitrofurantoin did not form inhibition halo. In the juvenile stage, an inhibition halo was obtained only with chloramphenicol and ciprofloxacin, reaching large halo diameters: 38 mm (355.39 µg/mL) and 33 mm (34.89 µg/mL), respectively. Nitrofurantoin presented no inhibition halo. In the adult stage, the diameters of the inhibition halo with chloramphenicol and ciprofloxacin increased as the amount of organisms increased, reaching values ranking from 26 to 33 mm for chloramphenicol (170.62 to 262.68 µg/mL) and 29 to 40 mm for ciprofloxacin (27.56 to 50.41 µg/mL). Nitrofurantoin presented no inhibition halo. It can be concluded that: the used antibiotics, chloramphenicol, ciprofloxacin, and nitrofurantoin, presented inhibition areas against the A. hydrophila bacterium; the 4 h period is sufficient to fill the digestive tract of Artemia metanauplii, juveniles, and adults, as well as to saturate Artemia nauplii, with the chloramphenicol and ciprofloxacin antibiotics. Regarding nitrofurantoin, positive results were only obtained in the nauplii stage. Even if larger concentrations of the antibiotic are reached in the Artemia digestive tract, leaving the organism for a longer time in the enriched solution would affect its survival. When working with antibiotics it is indispensable to know the maximal amount tolerated by the carrier organism, in this case Artemia, to be able to recommend the adequate dose. This work revealed that for the antibiotics chloramphenicol (base antibiotic) and ciprofloxacin (Ciproflox®, 250 mg caplets), commercial presentation, it is necessary to make 50% dilutions, since Artemia does not tolerate the commercial concentration. The antibiotic nitrofurantoin (Macrodantina®, 50 mg caplets), by not yielding positive results in the metanauplius, juvenile, and adult stages, raises the possibility of testing higher doses. Although this paper was aimed at being able to incorporate commercial antibiotics, easily available, to different developmental stages of Artemia to achieve inhibition in A. hydrophila, it is worthwhile mentioning that to treat diseases caused by this bacterium with chloramphenicol in fishes of 454 g, the recommendations are: 658,068 to 1,974,204 nauplii; 856,604 to 2,569,813 metanauplii; 703 to 2,110 juveniles; and 293 to 879 adults. This means that use of more advanced stages, i.e., juveniles and adults, allows using smaller amounts of organisms to reach the required doses for prophylactic treatments.
El gran desarrollo que ha tenido la acuicultura en el mundo en los últimos años, ha inducido el mejoramiento de técnicas de cultivo, con las que se manejan grandes densidades de organismos en espacios reducidos; ésto ha permitido, por un lado, un incremento en los rendimientos de producción en la acuicultura, pero también han aparecido, con mayor frecuencia, enfermedades en los organismos en cultivo, provocando altas mortalidades y pérdidas económicas (Alderman, 1988). El desarrollo de biotecnias que utilizan al alimento vivo como transportador, no solo de sustancias enriquecedoras sino también de sustancias profilácticas y terapéuticas que permitan eliminar o disminuir a los organismos patógenos, ya que el medicamento no se pierde en el agua y se puede suministrar la dosis adecuada que necesita cada especie y en cada fase de su desarrollo. El crustáceo Artemia se ha utilizado como agente transportador de medicamentos, principalmente en su etapa de nauplio, por su fácil disponibilidad, manejo y por su tamaño que sirve como alimento en las primeras etapas de vida de las especies acuícolas en cultivo (Castro et al., 2003). También, el emplear las otras fases de desarrollo: metanauplios, juveniles y adultos de este crustáceo, han permitido tratar enfermedades en organismos juveniles, adultos y aún hasta reproductores, evitando así la transmisión horizontal y vertical del patógeno, y la consecuente pérdida económica por la muerte de los organismos en cultivo causada por enfermedades virales, bacterianas, micóticas y parasitarias. El desarrollo de esta investigación, permitió determinar la incorporación de antibióticos, en las diferentes fases de desarrollo Artemia, nauplio, metanauplio, juvenil y adulto, para inhibir a la bacteria patógena Aeromona hydrophila, la cual aparece en sistemas de cultivo de peces de agua dulce, puede causar daños morfológicos, fisiológicos y mortalidad en los organismos, y con las consiguientes pérdidas económicas de los acuicultores. Los antibióticos utilizados fueron Cloranfenicol (antibiótico base), Nitrofurantoina (Macrodantinaâ, cápsulas 50 mg) y Ciprofloxacino (Ciprofloxâ, cápsulas de 250 mg). Se hizo un bioensayo para cada etapa de Artemia con cada uno de los antibióticos mencionados. Con nauplios, se colocaron 5,000 organismos (10 org/mL) en un vaso de precipitado con 500 mL con agua a 40 g/L de salinidad, 23 ± 2 °C de temperatura y aeración constante. En cada vaso, se agregó el antibiótico y después de 4 h, los nauplios se filtraron y se lavaron con agua dulce y se trituraron en un mortero. En cajas de Petri con medio de agar soya tripticaseina (TSBA) y con 1 mL del inóculo de bacteria, se hicieron cuatro pequeñas excavaciones (pozos), uno para cada antibiótico y uno para el testigo. Posteriormente se colocó, en cada pozo, 1 mL del triturado de nauplios. Las cajas de Petri se colocaron en la incubadora durante 24 h a 37 °C y se midieron los halos de inhibición. Para el bioensayo con los metanauplios, de 48 h de nacidos, el procedimiento de incorporación y determinación del efecto del antibiótico ante la bacteria fue el mismo que se siguió con los nauplios. En los bioensayos con juveniles de Artemia, se tomaron del cultivo 200 organismos juveniles (de 10- 12 días de nacidos) y se colocaron en vasos de precipitado de 1 L con 500 mL de agua a 40g/L de salinidad, esto se hizo para cada antibiótico; los organismos se dejaron 24 h sin ningún alimento y posteriormente se incorporó cada uno de los antibióticos y se dejaron 4 h en esta solución. Después, los organismos se lavaron con agua dulce y se hicieron cinco grupos de 5, 10, 15, 25, 50 individuos y el testigo. Cada grupo se colocó en un mortero y se trituró. Para evaluar el efecto de los antibióticos en esta etapa de desarrollo, se siguió la misma técnica que para nauplios y metanauplios. Para los bioensayos con la etapa adulta (>15 días de haber nacido), el procedimiento de incorporación y determinación del efecto del antibiótico ante la bacteria fue el mismo que se siguió con los juveniles. Para obtener los resultados, primero se elaboró la curva de calibración para cada antibiótico, la cual fue linear (R² =0.9944 para cloranfenicol; R² =0.9616 para ciprofloxacino; y, R² =0.9721 para nitrofurantoina) y, la relación entre la concentración de cada antibiótico contra el área de inhibición se expresa bajo la fórmula: Y=3.192X+5E-14 para cloranfenicol; Y=24.517X+2E-13 para ciprofloxacino; y, Y=0.2831X-6E-14 para nitrofurantoina. Con estos valores, se calculó la concentración alcanzada de cada uno de los antibióticos incorporados en nauplios, metanauplios, juveniles y adultos de Artemia franciscana. Las técnicas de extracción para identificar la presencia de los antibióticos dieron buenos resultados en el agua, tracto digestivo y en las heces fecales. En el agua, el sobrenadante se presentaron halos de inhibición, encontrando que el antibiótico cloranfenicol fue el que presentó el diámetro de halo más grande (13.75 ± 1.77 mm) con respecto a los otros dos antibióticos, alcanzando una concentración de 46.53 µg/mL; en el precipitado, el ciprofloxacino y la nitrofurantoina, dieron halos de inhibición de 18.55 mm (11.2 µg/mL ) y 18 mm (898.55 µg/mL) respectivamente. En el tracto digestivo, los tres antibióticos dieron halos de inhibición por arriba de 14 mm de diámetro. El ciprofloxacino alcanzó el valor más alto con 19.5 ± 0.71 mm que corresponde a 11.56 ug/mL del antibiótico. En las heces fecales, encontraron valores del diámetro de halo de inhibición por arriba de los 20 mm en los tres antibióticos, la concentración de los antibióticos en las heces fecales fue alta, alcanzando concentraciones de 287.87 µg/mL en cloranfenicol. El pH dentro del tracto digestivo de Artemia no presentó ningún problema para los antibióticos. Con respecto a los bioensayos de incorporación de antibióticos se determinó que los metanauplios, juveniles y adultos de Artemia requieren de 4 h para que su tracto digestivo se llene. En los nauplios, el antibiótico que provocó el mayor halo de inhibición fue la nitrofurantoina con un valor promedio de 22.26 mm, dando una concentración de 1,375.42 µg/mL. Los otros dos antibióticos presentaron halos de inhibición ligeramente por arriba de 10 mm. En los metanauplios, el antibiótico que presentó mayor halo de inhibición fue el ciprofloxacino con un valor medio de 22.57 mm (16.32 µg/mL), el cloranfenicol con 15.4 mm (58.37 µg/mL) y la nitrofurantoina no formó halo de inhibición. En la fase juvenil, solamente se obtuvo un halo de inhibición con los antibióticos cloranfenicol y ciprofloxacino, alcanzando valores altos en el diámetro del halo con 38 mm (355.39 µg/mL) y 33 mm (34.89 µg/mL) respectivamente. La nitrofurantoina no presentó halo de inhibición. En la fase adulta, con los antibióticos cloranfenicol y en ciprofloxacino, se pudo observar un incremento en el tamaño del diámetro de halo de inhibición conforme la cantidad de organismos aumentaba, obteniendo valores que van de 26 hasta 33 mm en cloranfenicol (170.62 a 262.68 µg/mL) y, 29 hasta 40 mm en ciprofloxacino (27.56 a 50.41 µg/mL). La nitrofurantoina no presentó halo de inhibición. Se puede concluir que los antibióticos cloronafenicol, ciprofloxacino y nitrofurantoina presentaron áreas de inhibición contra la bacteria A. hydrophila; que el periodo de cuatro horas es suficiente para llenar el tracto digestivo de los metanauplios, juveniles y adultos y saturar a los nauplios de Artemia con los antibióticos cloranfernicol y ciprofloxacino; en cuanto al antibiótico nitrofurantoina solo se tuvo resultados positivos en la etapa naupliar. Aunque se alcancen mayores concentraciones de antibiótico en el tracto digestivo de Artemia, al dejarla más tiempo en la solución enriquecedora, su sobrevivencia se ve afectada. En todo trabajo que se realiza con antibiótico es indispensable conocer la cantidad máxima que soporta el organismo transportador, en este caso Artemia, para poder recomendar la dosis adecuada. Este trabajo dio como resultado que para los antibióticos cloranfenicol (antibiótico base) y ciprofloxacino (Ciprofloxâ, cápsulas de 250 mg), presentación comercial, es necesario hacer diluciones al 50 % debido ya que Artemia no soporta la concentración comercial. El antibiótico nitrofurantoína (Macrodantinaâ, cápsulas 50 mg), al no dar resultados positivos en las fases de metanauplio, juvenil y adulto, surge la recomendación de probar con mayor dosis. Aunque en este trabajo el objetivo fue llegar a incorporar antibióticos comerciales, de fácil adquisición, a diferentes fases de desarrollo de Artemia y lograr inhibir el crecimiento de la bacteria A. hydrophila, es conveniente señalar que para tratar profilácticamente a un pez de 454 g contra esta bacteria con el antibiótico cloranfenicol, se recomienda proporcionar 658,068 a 1,974,204 nauplios; 856,604 a 2,569,813 metanauplios; 703 a 2,110 juveniles; o 293 a 879 adultos de Artemia. Esto quiere decir, que el utilizar etapas más avanzadas como es juvenil y adulto de Artemia, permite con menor número de organismos alcanzar las dosis requeridas en los tratamientos profilácticos.
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