Canine overpopulation is a potential human health risk. Several reproductive control strategies have been used in female dogs such as surgical sterilization, hormone therapy, immunocontraceptionand recently, the use of plant-derived compounds with similar structure to estradiol (phytoestrogens) having estrogenic activity with a direct impact on the reproductive physiology. Up to now, no molecular mechanisms involved in the action of phytoestrogens such as coumestrol are to ovarian level are known. In this study, DNA microarrays were used to identify the expression alterations of potential target genes in order to know the possible mechanisms used by coumestrol. Ovaries from adult female dogs were obtained by surgical dissection and transported to the lab. Cortical 30 mg sections were obtained, embedded in calcium alginate microcapsules with four Coumestrol concentrations (0,1,2,4 and 8 ng/ml) and incubated for a 4 hour period. Total RNA was isolated, quantified and integrity evaluated by alkaline agarose gel electrophoresis. cDNA was labeled with either Alexa555- (Control) or Alexa647-ddUTP (Coumestrol treated) fluorochromes, and used for sequential hybridization of microarrays (M22K_08_31 to 34). We used GenArise to filtrate, transform and normalize the rough data. Z score representing the change in expression level was used as criteria for transcriptional induction or repression. Data having Z values > ±2 were used in MAGNET program for system analysis based on GEO. The Masson trichrome staining of treated fragments and exfoliative vaginal cytology (CVE) from every bitch from where the ovaries were extracted were used to determine the stage in the estral cycle of each female donor dog. Data from follicular diameter and percentage consistent with other studies conducted, and no difference in histoarchitecture after incubation with Coumestrol with any of the concentrations used were found. Determination of estral cycle by vaginal exfoliative citology let us know that 80% of female dogs were at estrous stage allowing us to evaluate the coumestrol gene expression alteration at the main reproductive event named ovulation. A total of 38 genes were induced and 31 genes were repressed inresponse to all coumestrol concentrations tested and a lesser proportion responding only to two independent concentrations, confidence was obtained when comparing induced/repressed genes and we found no contradictory information because no induced gene was repressed at same time. We suggest that metabolic pathways such as mechanical trasduction (ILK, Notch) and colesterol synthesis were induced, while the repressed were mainly those associated to ubiquitination, cell cycle regulation and focal adhesion. In summary, we found correlation between increased concentration gene expression coumestrol with both the induced and repressed coumestrol propose that induces de novo synthesis of steroids in our experimental model is observed.
La sobrepoblación canina es un riesgo potencial para la salud humana. Se han utilizado varias estrategias de control reproductivo en perras como la esterilización quirúrgica, tratamiento con hormonas, inmunoconcepción y recientemente el uso de compuestos de origen vegetal con estructura parecida al estradiol (fitoestrógenos) que tienen actividad estrogénica y que alteran la fisiología reproductiva. Hasta el momento se desconocen los mecanismos moleculares involucrados en la acción de los fitoestrógenos como el Coumestrol a nivel ovárico. En el presente estudio se utilizaron microarreglos de ADN para identificar las alteraciones en la expresión de potenciales genes blanco con el fin de conocer los posibles mecanismos de acción por los que actua el Coumestrol. Los ovarios de cinco perras, se obtuvieron asépticamente y se transportaron al laboratorio. Después de remover la porción medular, fragmentos de 30 mg de la porción cortical se incluyeron en microcapsulas de alginato de Calcio con cuatro concentraciones de Coumestrol (0,1, 2, 4 y 8 ng/ml) y se incubaron a 37°C, 5% CO₂ en aire por 4 h. Se extrajo el ARN por el método de Trizol ®, se cuantificó en Nanodrop® y evaluó su integridad por electroforesis en gel reductor de agarosa. Se marcó el cADN por incorporación de ddUTP-Alexa555 para el control y ddUTP-Alexa647 para las muestras experimentales durante la síntesis de cADN, el cual se utilizó para la hibridación de los microarreglos supervisados (M22K_08_31, al 34). La hibridación se realizó primeramente en el control, se registró la fluorescencia de los 22000 puntos de los que consta el microarreglo para después de remover los oligos unidos, se hibridizaron los cADN experimentales y se registró nuevamente la fluorescencia de los puntos del microarreglo. Para el análisis y conversión de pixeles/µm2 a intensidad de la señal en cada registro, se utilizó el programa GenArise para los filtrados pertinentes. Después de la normalización y eliminación de señales de fondo, delimitación de la señal bruta y específica, los diferentes genes se agruparon en niveles de expresión en base al índice Z. Aquellos genes que tuvieron variaciones (índice Z) superiores a ± 2, se sometieron al programa MAGNET para el análisis de sistemas, basado en GEO. A cada una de las perras, a las que se extrajeron los ovarios se les deteminó la etapa del ciclo estral, uno de los fragmentos ováricos tratados se tiñó con la técnica tricrómica de Masson, y se evaluó la citología vaginal exfoliativa. Los datos obtenidos de diámetro y porcentaje folicular concuerdan con otros estudios realizados, y no se encontraron diferencias en la histoarquitectura después de la incubación con Coumestrol con ninguna de las concentraciones utilizadas La determinación del ciclo estral por citología vaginal exfoliativa, nos permitió saber que el 80% de las perras se encontraban en estro, por lo que se debe tomar en cuenta la inducción de genes en la fisiología reproductiva en el momento de la extracción ovárica. Hubo expresión génica diferencial ya que ningún gen inducido se encontró reprimido al mismo tiempo, 38 genes se encontraron inducidos, y 31 genes reprimidos en común a todos tratamientos. En conjunto, estos resultados sugieren que las vías metabólicas inducidas fueron las de mecanotransducción, (ILK, Notch,), síntesis de colesterol, y las vías reprimidas principalmente fueron las vías involucradas con ubiquitacion, regulación del ciclo celular, y de adhesión focal. Se observó una correlación entre el aumento de la concentración de coumestrol con un aumento en la expresión génica tanto inducida como reprimida proponemos que el coumestrol, induce de novo, la síntesis de colesterol en nuestro modelo experimental.
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