Evaluación de la expresión génica de ovarios de Canis lupus familiaris tratados in vitro con Coumestrol Público Deposited

La sobrepoblación canina es un riesgo potencial para la salud humana. Se han utilizado varias estrategias de control reproductivo en perras como la esterilización quirúrgica, tratamiento con hormonas, inmunoconcepción y recientemente el uso de compuestos de origen vegetal con estructura parecida al estradiol (fitoestrógenos) que tienen actividad estrogénica y que alteran la fisiología reproductiva. Hasta el momento se desconocen los mecanismos moleculares involucrados en la acción de los fitoestrógenos como el Coumestrol a nivel ovárico. En el presente estudio se utilizaron microarreglos de ADN para identificar las alteraciones en la expresión de potenciales genes blanco con el fin de conocer los posibles mecanismos de acción por los que actua el Coumestrol. Los ovarios de cinco perras, se obtuvieron asépticamente y se transportaron al laboratorio. Después de remover la porción medular, fragmentos de 30 mg de la porción cortical se incluyeron en microcapsulas de alginato de Calcio con cuatro concentraciones de Coumestrol (0,1, 2, 4 y 8 ng/ml) y se incubaron a 37°C, 5% CO₂ en aire por 4 h. Se extrajo el ARN por el método de Trizol ®, se cuantificó en Nanodrop® y evaluó su integridad por electroforesis en gel reductor de agarosa. Se marcó el cADN por incorporación de ddUTP-Alexa555 para el control y ddUTP-Alexa647 para las muestras experimentales durante la síntesis de cADN, el cual se utilizó para la hibridación de los microarreglos supervisados (M22K_08_31, al 34). La hibridación se realizó primeramente en el control, se registró la fluorescencia de los 22000 puntos de los que consta el microarreglo para después de remover los oligos unidos, se hibridizaron los cADN experimentales y se registró nuevamente la fluorescencia de los puntos del microarreglo.

Para el análisis y conversión de pixeles/µm2 a intensidad de la señal en cada registro, se utilizó el programa GenArise para los filtrados pertinentes. Después de la normalización y eliminación de señales de fondo, delimitación de la señal bruta y específica, los diferentes genes se agruparon en niveles de expresión en base al índice Z. Aquellos genes que tuvieron variaciones (índice Z) superiores a ± 2, se sometieron al programa MAGNET para el análisis de sistemas, basado en GEO. A cada una de las perras, a las que se extrajeron los ovarios se les deteminó la etapa del ciclo estral, uno de los fragmentos ováricos tratados se tiñó con la técnica tricrómica de Masson, y se evaluó la citología vaginal exfoliativa. Los datos obtenidos de diámetro y porcentaje folicular concuerdan con otros estudios realizados, y no se encontraron diferencias en la histoarquitectura después de la incubación con Coumestrol con ninguna de las concentraciones utilizadas La determinación del ciclo estral por citología vaginal exfoliativa, nos permitió saber que el 80% de las perras se encontraban en estro, por lo que se debe tomar en cuenta la inducción de genes en la fisiología reproductiva en el momento de la extracción ovárica. Hubo expresión génica diferencial ya que ningún gen inducido se encontró reprimido al mismo tiempo, 38 genes se encontraron inducidos, y 31 genes reprimidos en común a todos tratamientos. En conjunto, estos resultados sugieren que las vías metabólicas inducidas fueron las de mecanotransducción, (ILK, Notch,), síntesis de colesterol, y las vías reprimidas principalmente fueron las vías involucradas con ubiquitacion, regulación del ciclo celular, y de adhesión focal. Se observó una correlación entre el aumento de la concentración de coumestrol con un aumento en la expresión génica tanto inducida como reprimida proponemos que el coumestrol, induce de novo, la síntesis de colesterol en nuestro modelo experimental.

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  • 2014
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Última modificación: 09/28/2022
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