Estudio de los mecanismos de remoción de hexadecano por los cultivos puros y mixtos derivados de un consorcio bacteriano Público Deposited
El objetivo de este trabajo fue determinar los mecanismos de remoción de hexadecano (HXD) empleados por los cultivos puros y mixtos, derivados de un consorcio bacteriano, durante la degradación de HXD. Las cepas bacterianas se aislaron de muestras de un biorreactor de columna de burbujas, operado en ciclos secuenciales de 14 días, con HXD como única fuente de carbono y energía. El biorreactor fue inicialmente inoculado con una suspensión bacteriana aislada de la rizósfera de Cyperus laxus Lam, una planta nativa que crece cerca de una refinería de petróleo en operación en el Estado de Veracruz. Se aislaron cuatro cepas bacterianas y fueron identificadas mediante la secuenciación del gen ribosomal RNAr 16S como: Xanthomonas sp. UAM58, Acinetobacter bouvetii UAM25, Shewanella sp. UAM38 y Defluvibacter lusatiensis UAM86. Los estudios de degradación de HXD se desarrollaron en botellas serológicas (125 mL) con 50 mL de medio mineral salino (MMS), 13 g/L de HXD, y un inóculo de 1x106 UFC/mL. Los cultivos se desarrollaron por triplicado (30°C; 200 rpm; 15 días) realizando un muestreo a los 0, 2, 5, 10 y 15 días de cultivo. Las variables de respuesta analizadas fueron: la concentración de HXD, el crecimiento bacteriano, la hidrofobicidad celular, la capacidad de pseudosolubilización y emulsificación del HXD. Con el propósito de conocer los sistemas enzimáticos involucrados en la oxidación del HXD se investigaron diferentes genes catabólicos mediante PCR. En esta etapa se logró identificar los genes alkB y alkM. Los biosurfactantes se detectaron mediante las siguientes pruebas: tensión superficial, colapso de la gota y desplazamiento de la gota del petróleo. Esta última prueba también fue empleada para determinar, indirectamente, la concentración de biosurfactactantes expresada como equivalentes de Tween 20. Al cabo de 15 días de cultivo se encontró que la capacidad para degradar HXD fue diferente para cada cepa por separado. Se observó que la eficiencia de degradación de HXD fue significativamente mayor para A. bouvetii (72±4%), seguida de Xanthomonas sp. (46±4%) y D. lusatiensis (40±6%). Shewanella sp. no fue capaz de utilizar HXD como única fuente de carbono y energía. Se identificaron los genes que codifican para la alcano monooxigenasa en los cultivos puros y se identificó el gen homólogo alkM en A. bouvetii. Además, A. bouvetii fue la única cepa del consorcio productora de biosurfactantes alcanzando una máxima concentración a los 5 días (0.17 ± 0.03 g/L de equivalentes de Tween 20). Con base en la capacidad de degradación de HXD de los cultivos puros, se diseñaron y evaluaron cuatro cultivos mixtos. Se observó un incremento en la degradación de HXD, particularmente, en los cultivos Xanthomonas sp.+A. bouvetii (74±7%) y el consorcio bacteriano, constituido por las cuatro cepas (79±3%). Los mecanismos de remoción de HXD se evaluaron en el cultivo puro de A. bouvetii, el cultivo mixto integrado por Xanthomonas sp.+A. bouvetii y el consorcio, debido a su alta eficiencia de degradación de HXD. Se consideraron las cinéticas de hidrofobicidad celular, la capacidad de pseudosolubilización y emulsificación de HXD para determinar los mecanismos de remoción. Los resultados indicaron que A. bouvetii empleó tanto el contacto directo como la remoción mediada por biosurfactantes para la degradación de HXD. En el caso de los cultivos Xanthomonas sp.+A. bouvetii y el consorcio bacteriano, ambos mecanismos tomaron lugar; pero la remoción facilitada por biosurfactantes fue predominante al finalizar el tiempo de cultivo. En particular, en el consorcio la emulsificación fue predominante después de los 5 días de cultivo. Por lo tanto, los cambios en la hidrofobicidad celular y el grado de pseudosolubilización o emulsificación, fueron factores clave para la remoción de sustratos hidrofóbicos por los cultivos puros y mixtos evaluados. Además las asociaciones poblacionales entre las cepas del consorcio bacteriano, jugaron un papel importante en los mecanismos de remoción de HXD. Este trabajo es el primer estudio que muestra la capacidad degradadora de hidrocarburos de D. lusatiensis y A. bouvetii. Asimismo, este estudio revela a A. bouvetii como una cepa productora de biosurfactantes. Finalmente, este trabajo contribuye a entender los mecanismos de remoción de hidrocarburos entre cultivos bacterianos puros y mixtos.
The aim of this study was to determine the mechanisms of hexadecane (HXD) uptake among pure and mixed cultures, derived from a bacterial consortium, during of HXD transformation. Bacterial strains were isolated from samples a bubble column reactor operated in sequential batch, with HXD as sole carbon source and energy. The bioreactor was initially inoculated with a bacterial suspension obtained from rhizosphere of Cyperus Laxus Lam, a native plant able to grow in a highly contaminated swamp adjacent to an operating refinery in Veracruz. Four bacterial strains were isolated and identified by nucleotide sequence analysis (16S rRNA gene). The bacterial strains were identified as Xanthomonas sp., Acinetobacter bouvetii, Shewanella sp. and Defluvibacter lusatiensis. Biodegradation assays were conducted in 125 mL serological bottles containing a saline mineral medium (SMM), HXD (13 g/L) and an inoculum of 1x106 CFU /mL. Cultures were performed in triplicate (30°C; 200 rpm; 15 days) and sampled at 0, 2, 5, 10 and 15 days. Analyses of residual HXD, bacterial growth, cell surface hydrophobicity, pseudosolubilization and emulsification capacity were determined. In order to determine enzymatic systems involved in the HXD degradation, we identified different catabolic genes by PCR. As a result, we identified the alkB and alkM genes. Biosurfactants were detected by the following methods: surface tension, collapsed drop and oil spreading. Biosurfactant concentration was indirect determined by the oil spred method and expressed as equivalents of Tween 20. After 15 days growth, HXD was degraded by the pure cultures of A. bouvetii (72±4%), Xanthomonas sp. (46±4%) and D. lusatiensis (40±6%), but not by Shewanella sp. We identified the alkM gene in A. bouvetii. In addition, A. bouvetii was the only biosurfactant producer, reaching a maximum concentration at 5 days (0.17 ± 0.03 g/L equivalents of Tween 20). Based on degrading abilities of pure cultures, we tested four mixed cultures. As a result, the mixed cultures showed and enhanced HXD degradation, particularly with the culture Xanthomonas sp.+A. bouvetii (74±7%) and the bacterial consortium (79±3%). Since A. bouvetii, the culture with Xanthomonas sp.+A. bouvetii and the consortium were the best degraders, the mechanisms of HXD uptake were determined. The kinetics of cell surface hydrophobicity, the pseudosolubilization and emulsification capacities were considered to characterize the uptake mechanisms. Our findings showed that A. bouvetii combined both direct contact and biosurfactant-mediated uptake. For the culture Xanthomonas sp.+A. bouvetii and the consortium both mechanisms took place; however, the biosurfactant-mediated uptake was predominant at the end of culture time. Particularly, the emulsification was predominant in the consortium after 5 days. The changes in the cell surface hydrophobicity and the pseudosolubilization and emulsification extent were key factors for the hydrophobic substrate degradation. Also, associations among members of the consortium, played an important role in the uptake mechanisms by the mixed cultures. This is the first report of D. lusatiensis and A. bouvetii as hydrocarbon degrader strains and reveals A. bouvetii as a biosurfactant producer. Our results contribute to understand the HXD uptake mechanisms by pure and mixed cultures.
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