Efecto del pH sobre la afinidad de quimopapaína con el inhibidor cistatina de pollo: una asociación enzima‒inhibidor modulada por interacción electrostática Público Deposited
En el presente trabajo se estudió la dependencia de la constante de unión (Kb) de la quimopapaína -una cisteinproteasa representativa tipo papaína- con el inhibidor cistatina de pollo (CEW, denotado en el presente trabajo por las siglas de chicken egg white) con respecto a la variación del pH. Los estudios efectuados con métodos espectroscópicos se realizaron con quimopapaína teniendo bloqueada su Cys catalítica (carboximetilada) y cistatina de pollo en su forma cortada en el extremo amino terminal en Gly⁹ , resultado de su purificación a partir de clara de huevo de pollo. El análisis de los espectros de dicroísmo circular en la región ultravioleta lejano de las proteínas individuales en el intervalo de pH de [3.5‒10.0] a 25 °C, no revela evidencia de un cambio significativo en estructura secundaria de proteína. En los espectros de absorbancia en la región ultravioleta cercano a valores de pH alcalinos, no se observó señal de la ionización de la cadena lateral de Tyr. Esta observación se confirmó en los espectros de emisión de fluorescencia de las proteínas individuales y de la mezcla. La unión de quimopapaína con cistatina de pollo presenta una moderada afinidad, el sistema presenta una Kb de (5.71 ± 0.27) x 10⁶ M⁻¹ (una Kd de (176 ± 8) nM) a pH 7.4, 25° C (Kd fue determinada por el método de titulación fluorimétrica y Kb calculada como: Kb= Kd -1 ). Mediante el método de titulación fluorimétrica se determinó la constante de disociación (Kd) del sistema a 14 diferentes valores de pH a una fuerza iónica (I) de 0.11 M en el intervalo [6.0‒10.0] y a 5 diferentes valores de pH con una I de 0.011 M en el intervalo [3.5‒ 6.5]. Estos experimentos se realizaron en presencia de su respectivo amortiguador de pH a 25 ºC. La Kd determinada a dos distintas fuerzas iónicas (I = 0.011 M y I = 0.11 M) a valores de pH de 6.0 y 6.5, mostró una diferencia de aproximadamente diez veces mayor en magnitud, evidencia de que la asociación quimopapaína‒cistatina de pollo es modulada por interacción electrostática.
La variación de Kb (calculada como Kb=Kd⁻ⁱ ) con el pH se logró describir apropiadamente con el modelo modificado de transferencia de protón (MPLM), propuesto por Crnogorac et al. (2001), con la presencia de tres grupos ionizables isoacídicos. Con el propósito de elucidar mejor el mecanismo de unión se construyó un modelo de la estructura tridimensional del complejo quimopapaína‒CEW. El análisis de la distribución de residuos cargados sobre la interfase del complejo quimopapaína‒cistatina a un radio de corte < 5 Å de las cadenas, reveló la presencia de ocho residuos ionizables sobre quimopapaína (Y ⁶¹, K⁶⁴, Y⁶⁷ , K¹³⁹, K¹⁴⁵, K¹⁵⁶, D¹⁵⁸ y H¹⁵⁹) y cinco sobre cistatina (E¹⁹, G⁹ N-terminal, R⁵², K⁵⁹ y Y ¹⁰⁰). El cálculo teórico del componente electrostático de la energía libre de unión (ΔGb,elec) del complejo quimopapaína‒CEW a los diferentes valores de pH examinados describe cualitativamente el comportamiento experimental observado de la energía libre de unión (ΔGb) como función del pH. ΔGb,elec se calculó empleando un modelo con solvente implícito basado en la resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann. Durante la asociación de la quimopapaína con cistatina de pollo, las interacciones electrostáticas juegan un papel importante. Estas interacciones son moduladas por el pH del entorno que dicta su estado de protonación de acuerdo con el pKₐ de los residuos ionizables localizados en la interfase del heterodímero y en las proteínas separadas, por lo tanto, también determina la energía de unión electrostática. Proponemos que los residuos que participan en el par iónico entre cadenas, Lys¹³⁹ de quimopapaína y Glu¹⁹ de CEW, así como Tyr⁶¹ y Tyr⁶⁷ de quimopapaína, son los principales residuos responsables de la dependencia de la afinidad del heterodímero quimopapaína‒CEW observada experimentalmente con respecto a la variación del pH. Finalmente, en base al análisis comparativo de la interfase con estructuras cristalográficas ya reportadas de sistemas homólogos cisteinproteasa‒cistatina (PDB: 1STF, 3K9M, 1NB5, 3KSE, 3KFQ), se puede asumir que la dependencia de la constante de unión con respecto a la variación del pH, así como la contribución electrostática a la energía de unión están fuertemente vinculada a la presencia y distribución de grupos ionizables en la interfase, puentes de hidrógeno, pares iónicos y área superficial de contacto.
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