Exposure to urban airborne particles is associated with an increase in morbidity and mortality. Reactive oxygen species (ROS) induced by PM10 are thought to play an important role in the induction of adverse health effects, particularly cardiorespiratory and cancer. In this study we describe the events triggered in A549 cells exposed to a sub-lethal concentration (10 µg/cm2 ) PM10, which have been characterized for transition metals and endotoxin content. Evaluation of intarcellular ROS generation, glutathione levels, antioxidant enzymes activity [superoxide dismutase (SOD) and catalase], oxidative damage, DNA double strand breaks, and DNA-damage molecular signal from DNA double-strand breaks (γH2A.X 53BP1,ATM/ATR/Chk1/Chk2/p53), apoptosis and celular senescence was performed. Airborne PM10 was able to induce 1.8-fold increase in ROS generation and about a 60% glutathione decrease. Superoxide dismutase and catalase activity was reduced in 60% and 40% respectively after PM10 exposure, in addition lipoperoxidation and protein carbonylation were induced. Exposure to PM10 also induced the formation of DNA doublestrand breaks, γH2A.X generation, and 53BP1 recruitment. To protect the genome, cells activated the ATM/ATR/Chk1/Chk2/p53 pathway, however after 48 h cells turned into a senescence-like state determined by β-galactosidase, a marker associated to senescence. The antioxidant Trolox, was able to prevent most of the alterations caused by particulate matter exposure, indicating the important role of ROS as a mediator of PM10-induced genotoxicity. The ROS, DNA damage and a microenvironment altered in senescent-like cells could be a mechanism by which airborne particles could contribute to the risk of lung cancer.
Las aeropartículas contaminantes con un tamaño aerodinámico ≤ 10 µm (PM10) son un componente de la contaminación del aíre. Se sabe que las PM afectan la salud del ser humano y que son un factor de riesgo en el desarrollo de cáncer de pulmón. Se ha determinado que las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas por componentes de las PM10, como los metales, juegan un papel importante en los efectos inducidos por éstas. El objetivo de este trabajo fue determinar en células epiteliales de pulmón humano (A549) expuestas a una concentración subletal (10µg/cm2 ) de PM10 que contenían metales de transición como Fe, Cu y Ti, la inducción de estrés oxidante, daño oxidante a los lípidos, las proteínas y al DNA, las vías de respuesta por daño al DNA y la inducción de senescencia; así como determinar la participación del estrés oxidante mediante la utilización del antioxidante Trolox (TLX). Para esto se expusieron células A549 a una concentración subletal (10µg/cm2 ) de PM10 por 24 h, se evaluó la generación de ROS intracelular y los niveles de glutatión. Para determinar la lipoperoxidación se evaluó la generación de malondialdehido y la oxidación de proteínas se evaluó por medio de un oxyblot. El daño al DNA se determinó mediante la técnica de cometas. Los cambios en los niveles y la fosforilación de las proteínas se hizo por inmuno reconocimiento (Western-Blot). La co-localización de focos de daño a DNA se hizo mediante inmuno-fluorescencia, la apoptosis se evaluó por anexina V y la senescencia se evaluó por la técnica de Senescencia Asociada a β-galactosidasa. Para determinar la participación de las ROS se utilizó el secuestrador de radicales libres Trolox. La exposición a las PM10 por 24 h indujo un incremento de 1.8 veces la generación de ROS y se observó una disminución 60% en el contenido de glutatión total. Las PM Indujeron oxidación de lípidos y proteínas. También disminuyeron la actividad de las enzimas SOD (60 %) y de catalasa (40 %), se indujo rompimiento de la doble cadena del DNA y la vía de respuesta ante este daño, estuvo mediada por la vía de la proteína ATM. ATM fosforiló a la proteína H2A.X (γH2A.X) y se formaron focos de daño al DNA (ATM-γH2A.X). Debido a que la proteína 53BP1 se activó, lo que sugiere que ésta proteína también se está reclutando en los focos de daño al DNA. La exposición a las PM10 también indujo el incremento de p53; así como la fosforilación de p53(S15), eventos característicos de daño al DNA. Las PM10 indujeron cambios en la fosforilación de proteínas relacionadas con la detención del ciclo celular, para la reparación del DNA, tales como Chk1/Chk2 y la fosfatasa CDC25A. A las 24 h de exposición, no se observaron cambios en las fases del ciclo celular, tampoco se observó apoptosis. A las 48 h se observó que aproximadamente el 50% de las células expuestas a las PM10 presentaron un estado de Senescencia Asociada a β-galactosidasa. La senescencia está relacionada con la vía de respuesta de daño al DNA mediada por ATM y la activación de p53; así como por el estrés oxidante. TLX previno la mayoría de las alteraciones observadas después de que las células fueron expuestas a las PM10. Las PM10 indujeron daño oxidante y daño al DNA. La respuesta celular ante el daño al DNA estuvo mediada por la fosforilación de las proteínas ATM, -γH2A.X y 53BP1. En este trabajo se observó que a las 24 h las PM10 inducen estrés oxidante, daño genotóxico y células senescentes (capaces de alterar su microambiente) y si estos eventos se mantienen a largo plazo, podrían favorecer el desarrollo de cáncer de pulmón.
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