Análisis molecular del tipo de muerte celular inducido por la terapia coadyudante: metformina y el oxamato de sodio como inhibidores de la vía mtor y la glucólisis en un modelo celular triple negativo de cáncer de mama Public Deposited
Background: Chemotherapy is the backbone of systemic treatment for triple negative breast cancer (TNBC), which is one of the most relevant breast cancers molecular types due to the ability of tumor cells to develop drug resistance, highlighting the urgent need to develop newer and safer drug combinations for treatment. In this context, to overcome tumor cell drug resistance, we employed a novel combinatorial treatment including Doxorubicin, Metformin, and Sodium Oxamate (DoxMetOx). Such pharmacological combination targets indispensable hallmarks of cancer-related to aerobic glycolysis and DNA synthesis. Materials and Methods: The aim this work is analize the molecular level in BCTN cells line. Inhibition mTOR protein as well as the enzyme LDHA, and furthermore, induction of autophagy process generated by activating LC3, a primordial protein implicated in the conformation and elongation of the autophagolysosome. The induction autophagy was also determined by Transmision Electronic Microscopy (TEM) and Green Flourescent Protein GFP-LC3; both of them assys showing a considerable detection of LC3. Were also performed LDH-A activity assays, detection of apoptosis was determined through the release of LDH-A and glucose uptake. All treatments were compared with doxorubicin. Our results bring relevant implications for breast cancer treatment, they provide evidence about the link of apoptosis and autophagy employing mTOR and glycolysis inhibitors. Results: Cell cultures exposed in pairs and with triple therapy were evaluated as potential inducers of autophagy through activation of the LC3-II protein and inhibition of p-mTOR. Doxorubicin markedly increased the p-mTOR sign from the first 4 hours of exposure compared to Metformin and Oxamate; and the accumulation of LC3-II was not significant for any of the three drugs. The combination of MetOx after 12 hours of treatment had a p-mTOR inhibitory effect and moderate increase in the conversion of LC3-I to LC3-II from the first 4 hours.
Por otra parte, la terapia DoxMetOx a partir de las 4 horas de tratamiento inhibió por completo p-mTOR y aumentó significativamente la conversión de LC3-I a LC3-II al mismo tiempo de exposición del tratamiento. De igual modo en los ensayos de TEM y de GFP-LC3, la triple terapia indujo formación de autofagolisomas, sin embargo, con Doxorrubicina se observó daño masivo en tiempo corto. Estos resultados sugieren que la triple terapia probablemente induce autofagia temprana en el tumor, siendo aún más eficiente que la Doxorrubicina, fármaco de primera línea en CaMa TN. Conclusiones: Los estudios in vitro mostraron que DoxMetOx actúan juntos inhibiendo la fosforilación de mTOR y la expresión del gen LDH-A, promoviendo la apoptosis dependiente de la vía de las caspasas, acompañada de escisión de PARP. Se observó que la inducción del proceso de autofagia fue promovido por la acumulación de LC3-II, una proteína primordial implicada en la conformación y elongación del autofagolisosoma y la culminación de la autofagia. Es por ello que dentro de éste contexto, la falta de fármacos eficaces para inhibir el crecimiento de CaMa TN, es la principal causa de la falta de éxito terapéutico y de la recurrencia de la enfermedad. En éste trabajo hemos demostrado que la orientación de la combinación de DoxMetOx hacia vías moleculares clave en el cáncer, resultó ser un eficiente y rápido inhibidor de la proliferación celular. Nuestros hallazgos muestran que esta combinación puede llegar a ser una estrategia prometedora para las pacientes diagnosticados con tumores TN, para quienes desafortunadamente no existen terapias farmacológicas fiables.
La quimioterapia es la principal estrategia para el tratamiento sistémico del cáncer de mama triple negativo (CaMa TN), el cual es uno de los tipos moleculares más relevantes debido a la capacidad de las células tumorales para desarrollar resistencia a los medicamentos, destacando la necesidad urgente de desarrollar nuevas y más seguras combinaciones de fármacos para su tratamiento. En este contexto, para superar la resistencia de células tumorales a los fármacos, se empleó un nuevo tratamiento combinatorio que incluye doxorrubicina (Dox), metformina (Met) y oxamato de sodio (Ox); (DoxMetOx). Tal combinación farmacológica tiene como objetivo ser el blanco de marcadores indispensables de cáncer relacionados con la glucólisis aeróbia y la síntesis de ácidos nucléicos (DNA y RNA). Materiales y Métodos: Con el objetivo de elucidar el mecanismo de muerte celular promovido por los fármacos, se evaluó a nivel molecular la efectividad de los tratamientos sobre cultivos primarios de un modelo murino de xenotransplantes de CaMa TN de la línea celular MDA-MB-231. Los cultivos fueron expuestos a 4 tiempos de exposición a DoxMetOx y se realizaron análisis de Western Blot, Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) y microscopía de fluorescencia con la proteína verde fluorescente (GFP-LC3). Resultados: La posible inducción de autofagia a través de la activación de la proteína LC3-II e inhibición de p-mTOR fue evaluada en los cultivos celulares expuestos a tratamientos farmacológicos individuales, dobles y con la triple terapia,. La Doxorrubicina aumentó notablemente la señal de p-mTOR desde las primeras cuatro horas de exposición en comparación a la Metformina y el Oxamato; y la acumulación de LC3-II no fue considerable para ninguna de las tres drogas. La combinación de Met/Ox después de 12 horas de tratamiento, tuvo un efecto inhibitorio de p-mTOR y un incremento moderado en la conversión de LC3-I a LC3-II desde las primeras 4 horas.
On the other hand, DoxMetOx therapy from 4 hours of treatment completely inhibited p-mTOR and significantly increased the conversion of LC3-I to LC3-II at the same time of treatment exposure. Similarly in the TEM and GFP-LC3 assays, triple therapy induced autophagosome formation after 4 hours of exposure, however massive damage was observed with Doxorubicin at this time. As for the LDH-A release and activity and glucose uptake assays, the cultures exposed to triple therapy showed the decrease in the enzyme a difference of Doxorubicin, where no significant changes in the decrease of this important molecular marker in some types of cancer. Regarding the uptake of glucose, we observed a favorable effect in the decrease of the same on the cultures exposed to the triple therapy a difference of Doxorubicin, where there was no significant effect. These results suggest that triple therapy induces early autophagy in the tumor, being even more efficient than Doxorubicin, a first line drug in CaMa TN. Conclusions: in vitro studies showed that the three drugs act together inhibiting both mTOR phosphorylation and LDH-A gene expression, promoting caspase-3 dependent pathway apoptosis, accompanied by PARP cleavage. In addition, the induction of the autophagy process was observed by the accumulation of LC3-II, a primordial protein involved in the conformation and elongation of the autophagolysosome. The lack of effective drugs to inhibit the growth of CaMa TN, is the main cause of the lack of successful therapeutic failure and recurrence of the disease. In this work we have shown that the orientation of the combination of Doxorubicin, Metformin and Oxamate to key molecular pathways in cancer proved to be an efficient and rapid inhibitor of cell proliferation. Our findings prove to be a promising strategy for patients diagnosed with TN tumors, for whom unfortunately there are no reliable pharmacological therapies.
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