Desarrollo embrionario bovino in vitro co-cultivado con células oviductales y del cumulus oophorus Public Deposited
La producción in vitro de embriones (PIVE) comprende: la maduración in vitro (MIV) de ovocitos obtenidos por aspiración folicular; la fertilización in vitro (FIV) de estos ovocitos; y el cultivo in vitro de los embriones producidos; siendo la tasa de blastocistos el parámetro para medir su eficacia. La PIVE, en el bovino, ha sido motivo de múltiples investigaciones, debido a las bajas tasas de blastocistos obtenidos (5-30%), resultado del constante “bloqueo del desarrollo”; con el fin de evitarlo se han empleado co-cultivos con células somáticas, obteniendo resultados controversiales. La presente investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto del co-cultivo de los embriones con células oviductales y del cumulus oophorus sobre el porcentaje de embriones in vitro en estadio de blastocisto. Los oviductos y ovarios fueron colectados de hembras bovinas sacrificadas en un rastro, posteriormente fueron lavados y transportados en solución salina 0.9% a 30-35 °C. Las células oviductales fueron obtenidas tras una incisión longitudinal del oviducto, mientras que las células del cumulus oophorus se colectaron del líquido folicular; ambos tipos celulares se colocaron para su cultivo en TCM-199 con 20% de SFB. Los complejos cumulus-ovocitos (COC’s) fueron colectados por aspiración de folículos de 2 a 7 mm de diámetro y colocados para su maduración en TCM-199 con 10% de SFB, 0.5 µg/mL de FSH y 0.5 µg/mL de LH, a una temperatura de 38.5 °C, 5% CO2 y 95% humedad por 24 horas. Posteriormente se fertilizaron utilizando una concentración de 1x106 espermatozoides/mL. Los presuntos cigotos fueron divididos en tres tratamientos: 1. Control; 2. Co-cultivo con células de cumulus; 3. Co-cultivo con células del oviducto. El desarrollo fue evaluado hasta las 192 horas, determinando la cantidad de embriones divididos, mórulas y blastocistos. La maduración nuclear y la fertilización se evalúo mediante la tinción con Hoechst 33342. La proporción de ovocitos que alcanzaron la metafase II al finalizar su MIV fue de 90%; la tasa de fertilización fue de 84%. Posterior a la FIV fueron co-cultivados 538, 627 y 478 ovocitos en el tratamiento control, cumulus y oviducto, respectivamente. La mayor cantidad de blastocistos (14%) en el co-cultivo de cumulus, menor cantidad en el cocultivo de oviducto (7%) y finalmente la más baja en el control (4%). Se concluye que el uso de medios condicionados con células somáticas puede estimular el desarrollo hasta estadio de blastocisto in vitro de los embriones bovinos.
In vitro production (IVP) of embryos include: in vitro maturation (IVM) of oocytes obtained by follicular aspiration; in vitro fertilization (IVF) of these oocytes; and in vitro culture of embryos produced; being blastocyst rate the parameter to measure its efficacy. The IVP embryos, in cattle, has been subject to multiple investigations, due to low blastocysts rates obtained (5-30%), as result of a constant "development block"; with goal to avoid it there have been employed co-cultures with somatic cells, obtaining controversial results. The objective of the present study was to determine the effect of co-culture of embryos with oviductal cells and cumulus oophorus on the percentage of in vitro development embryos to the stage of blastocyst. Oviducts and ovaries were collected from female cattle slaughtered in a slaughterhouse, which were washed and transported in 0.9% saline at 30-35 °C. Oviductal cells were obtained after a longitudinal incision to oviduct, while cumulus oophorus cells from follicular fluid were collected, both cell types were placed in TCM199 with 20% FBS. Complex cumulus-oocytes (COC’s) were collected by aspiration of follicles 2 to 7 mm diameter and placed for maturation in TCM-199 with 10% FBS, 0.5 µg/mL FSH and 0.5 µg/mL LH, 38.5 °C temperature, 5% CO2 and 95% humidity for 24 hours. Oocytes were subsequently fertilized using a sperm concentration of 1x106 /mL. The presumptive zygotes were divided into three treatments: 1. Control; 2. Co-culture cumulus; 3. Co-culture oviduct. Development was evaluated until 192 hours, determining amount of cleavage embryos, morula and blastocyst. Nuclear maturation and fertilization was assessed by Hoechst staining (33342). The proportion of oocytes reaching metaphase II after IVM was 90%; fertilization rate was 84%. After IVF 538, 627 and 478 oocytes were co-cultured in the control, cumulus and oviduct treatment respectively. A greater number of blastocysts (14%) was obtained in the co-culture with cumulus cells, continued the co-culture with oviduct cells (7%) and finally the control (4%). It is conclude that somatic cell conditioned media can stimulate in the in vitro development until stage of blastocyst of bovine embryos.
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