Aspectos de seguridad de Enterococcus faecium MXVK29 y Enterococcus faecalis MXVK22 aislados de productos cárnicos y caracterización molecular de sus bacteriocinas Público Deposited

La bioconservación consiste en el uso controlado de microorganismos o sus metabolitos para controlar la microbiota de descomposición y/o los patógenos, así como para prolongar la vida útil e incrementar la calidad sanitaria de los alimentos. Los enterococos son bacterias acido lácticas (BAL) que contribuyen a las propiedades organolépticas de los alimentos fermentados, además de tener la capacidad de producir bacteriocinas (enterocinas). Estas bacteriocinas tienen altas posibilidades de ser utilizadas como conservadores naturales, con la ventaja de que pueden ser degradadas por las enzimas proteolíticas presentes en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, algunos estudios han demostrado que el género Enterococcus puede ser portadores de genes de resistencia, o bien de genes que codifican para algunos factores de virulencia. Desde el punto de vista de la seguridad alimentaria estos aspectos pueden ser una limitante en el uso de este género en los alimentos. El propósito de este trabajo fue identificar si las cepas Enterococcus faecium MXVK29 y Enterococcus faecalis MXVK22 pueden ser utilizadas como posibles cultivos iniciadores. Para cumplir este objetivo se determinaron los siguientes parámetros: cinética de producción, determinación de la concentración mínima inhibitoria y capacidad de generar cepas resistentes del extracto de bacteriocina; así como la determinación de aspectos de seguridad de cepas de enterococos, incluyendo la purificación y caracterización molecular parcial e identificación de la enterocina producida por estos microorganismos. El perfil de producción de las bacteriocinas en estudio es el de un metabolito primario con una actividad antimicrobiana de 2133.33 UA/mL y 4266.66 UA/mL (enterocina producida por E. faecalis MXVK22 y E. faecium MXVK29, respectivamente). En las concentraciones de estudio (2133, 1066, 533, 267 y 134 UA/mL) se observó un efecto bacteriostático sobre las cepas de Listeria probadas (Listeria innocua ATCC33090, Listeria monocytogenes LM82 y Scott A), a excepción de Listeria monocytogenes LMB 911204/47, la cual no presentó un efecto inhibitorio con ninguna de las concentraciones utilizadas. Para eliminar el 100% del microorganismo sensible (Listeria sp.) es necesario adicionar al medio 2535, 6040, 3969 y 11021 UA/mL de la bacteriocina producida por E. faecium MXVK29; y 4263, 2425, 1209 y 3810 UA/mL de la bacteriocina producida por E. faecalis MXVK22 (Listeria innocua ATCC33090, Listeria monocytogenes LM82, LMB 911204/47 y Scott A, respectivamente). Se obtuvieron cepas resistentes de Listeria que muestran cambios en los perfiles genómicos con respecto a sus cepas sensibles, lo que indica que las bacteriocinas produjeron una resistencia con reflejo a nivel genómico, por lo cual éstas deben ser consideradas como parte de una tecnología de barreras y no como preservante único. De todos los factores de virulencia analizados (cylA, cylB y cylM, agg, gelE, esp, efaAfs, efaAfm, cpd, cob, ccf y ace) en Enterococcus faecalis MXVK22 y Enterococcus faecium MXVK29 (cepas testigo); solo el gen ccf que codifica para una feromona sexual fue amplificado por PCR para todas las cepasen estudio. La presencia de esta feromona es común en cepas de enterococos aisladas de diferentes fuentes (cultivos iniciadores, alimentos y clínicos) y no se considera una factor de virulencia mientras no se presente el gen agg (proteína de agregación). Enterococcus faecium MXVK29 fue sensible a todos los antibióticos probados, a diferencia de Enterococcus faecalis MXVK22, que presentó resistencia a vancomicina y tetraciclina. Enterococcus faecalis MXVK22, no presentó formación de aminas biogénicas con el método utilizado para el análisis, en contraste con Enterococcus faecium MXVK29 que tuvo actividad descarboxilasa positiva para la formación de tiramina. El rendimiento obtenido con el protocolo de purificación fue de 32.7% para el extracto de bacteriocina (EB) de Enterococcus faecium MXVK29 y 32.1% para el EB de Enterococcus faecalis MXVK22. La secuencia del extremo amino terminal de la molécula de bacteriocina producida por Enterococcus faecium MXVK29 presentó una secuencia consenso hidrofílica y catiónica YGNGV(X)C(X)4C, con dos residuos de cisteína en las posiciones 9 y 14. El fragmento amplificado por PCR tuvo una similitud del 100% con el péptido maduro de la enterocina A y B producidas por Enterococcus faecium MTCC5153. La secuencia consenso de las secuencias obtenidas fue alineada, obteniéndose una similitud del 100% con la secuencia parcial del operón de la enterocina A (entAIF) reportada en la base de datos del NCBI. Enterococcus faecium MXVK29 podría ser utilizado como parte de un método de bioconservación, ya sea como cultivo iniciador, cultivo bioprotector o como conservador natural en alimentos; además la enterocina A tienen un gran potencial para ser usada como conservador natural en alimentos.

Bioconservation is the controlled use of microorganisms or their metabolites to control the microflora in decomposition and also pathogens increasing the shelf life and improving the sanitary quality of food. Enterococci are lactic acid bacteria (LAB) that contribute to the organoleptic properties of fermented foods, as well as having the ability to produce bacteriocins (enterocin), which can be degraded by proteolytic enzymes present in the gastrointestinal tract; in addition they could be used as natural preservatives. However, some studies have demonstrated that the genus Enterococcus may act as reservoirs for antibiotic resistance genes, in addition, they may carry some virulence determinants, thus rising concerns about the safety of strains found in foods. The purpose of this study was to identify if the strain of Enterococcus faecium MXVK29 and Enterococcus faecalis MXVK22 can be used as potential fermentation starters. The methodology was divided in different seccions: production kinetics, minimum inhibitory concentration determination, capacity to generate resistant strains, determination of safety aspects of enterococci strains, purification and partial molecular characterization of enterocins. The profile for both bacteriocins is a primary metabolite and they showed an antimicrobial activity of 2133.33 AU/mL and 4266.66 AU/mL (enterocin produced by E. faecalis MXVK22 and E. faecium MXVK29, respectively). Bacteriocin concentrations (2133, 1066, 533, 267 and 134AU/mL) tested in this study have a bacteriostatic effect on Listeria strains, with the exception of Listeria monocytogenes 911204/47LMB, who did not show an inhibitory effect on any concentration. The minimum inhibitory concentration of bacteriocin was 2535, 6040, 3969, and 11021 UA/mL for bacteriocin produced by E. faecium MXVK29 and 4263, 2425, 1209 and 3810 AU/mL for bacteriocina produced by E. faecalis MXVK22 (Listeria innocua, Listeria monocytogenes LM82, LMB911204/47 and ScottA, respectively). Resistant strains of Listeria showed changes in genomic profiles where compared to sensitive strains. The virulence factors (cylA, cylB y cylM, agg, gelE, esp, efaAfs, efaAfm, cpd, cob, ccf y ace) were amplified by PCR in all strains tested (Enterococcus faecalis MXVK22 and Enterococcus faecium MXVK29), the ccf gene encoding a sex pheromone was positive for all strains tested. Enterococcus faecium MXVK29 was sensitive to all antibiotics tested, unlike Enterococcus faecalis MXVK22 that showed resistance to vancomycin and tetracycline. Enterococcus faecalis MXVK22 did not form any biogenic amines, in contrast to Enterococcus faecium MXVK29 that had positive activity decarboxylase for tyramine. The yield obtained with the purification protocol was 32.7% for the bacteriocin extract (EB) Enterococcus faecium MXVK29 and 32.1% for EB Enterococcus faecalis MXVK22. Amino terminal sequence of the bacteriocina produced by Enterococcus faecium MXVK29, presented a hydrophilic and cationic consensus sequence YGNGV(X)C(X)4C with two cysteine residues at positions 9 and 14. The PCR amplified fragment had 100% similarity to the mature peptide of enterocin A and enterocin B produced by Enterococcus faecium MTCC5153. The consensus sequence of the obtained sequences was aligned with100% similarity with the partial sequence of the enterocin operón (entAIF) reported in NCBI database. Enterococcus faecium MXVK29 could be used as part of a bioconservation method either as a starter culture, bioprotector culture or additive, additionally the enterocin A has a great potential for use as natural preservative in food.

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