Unbalanced diets, such as those consumed in Western countries, based on high proportions of carbohydrates and lipids, notably cholesterol, greatly contribute to nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), including its progressive form of non-alcoholic steatohepatitis. alcoholic (NASH). Thus, lipid overload is one of the main risk factors for initiation and progression of hepatocellular carcinoma (HCC), the main primary liver cancer, which is associated with a high incidence and mortality worldwide. The present work aimed to characterize the development of HCC in mice fed a Western diet, including the identification of a gene expression signature that defines a subtype of liver cancer raised in a lipid-overloaded liver context. Mice subjected to Western diets with focusing greater interest in high cholesterol content presented a greater number of tumors, of which they present both macroscopically angiogenesis determined by inspection of the tumors and microscopically by detecting CD34, a classic angiogenesis marker. In the same way, it was identified that these tumors under a lipid-overload environment present infiltration characterized through the identification of macrophages, of which we can assume through the detection of specific markers that these myeloid cells present an M2 polarity (pro-tumor polarity). RNA-seq identified a specific gene expression signature that reflected the aforementioned phenotypes. On the other hand, it is noteworthy that four mouse-human orthologous genes of this transcriptomic signature were able to predict survival and prognostic outcome in transcriptional data from patients with HCC. These four genes (Slc41a3, Fabp5, Mthfd1l and Igdcc4) have clinical relevance in liver carcinogenesis. These genes are overexpressed in HCC patients and are associated with poor survival. These four genes are widely implicated in metabolic and stem cells processes capacity. Metabolic reprogramming and stem cell capacity are some of the key characteristics of cancer. The transcriptomic signature proposed in this work clearly indicates a metabolic and stem adaptation committed to the adaptation of tumor cells in a process induced and driven by cholesterol overload. In conclusion, the consumption of diets enriched with lipids, in particular cholesterol, could favor the development of HCC with an aggressive phenotype and poor prognosis.
Las dietas desbalanceadas, como las que se encuentran en los países occidentales, basadas en altas proporciones de carbohidratos y lípidos, en particular el colesterol, contribuyen en gran medida a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), incluida su forma progresiva de esteatohepatitis no alcohólica (NASH). Es por eso por lo que, la sobrecarga de lípidos es uno de los principales factores de riesgo en el inicio y la progresión del carcinoma hepatocelular (HCC), el principal cáncer de hígado primario que se asocia con una alta incidencia y mortalidad a nivel mundial. Previamente, demostramos las propiedades de promoción de tumores hepáticos provocadas por el consumo de una dieta alta en colesterol en ratones. Los tumores generados presentaron un fenotipo agresivo, incluida la metástasis pulmonar, en comparación con los animales alimentados con una dieta balanceada. Estos resultados se asociarón fuertemente con daño al DNA mediado por estrés oxidativo, la falla en la activación de la principal maquinaria de la proteína reparadora del DNA y resistencia a la apoptosis. Los principales objetivos del presente trabajo fueron caracterizar la progresión del HCC con una etiología de NAFLD inducida por el consumo de dietas altas en lípidos, particularmente el aporte de colesterol e identificar el perfil de expresión génica asociado a esta característica particular. Por lo tanto, alimentamos a los animales hasta los 8 meses con una dieta tipo Western (altos en lípidos, colesterol y carbohidratos). Posteriormente, los ratones recibieron una dosis única de DEN para inducir la carcinogénesis hepática. Bajo la dieta tipo Western, los ratones presentaban signos de obesidad con aumento de peso y acumulación de grasa visceral, junto con la presencia de daño hepático. Estos hallazgos concuerdan con los observados en humanos con una dieta occidental y en otros modelos de ratón bien caracterizados de NAFLD. El tratamiento conjunto con DEN indujo eficazmente una mayor generación de tumores hepáticos en comparación con los grupos CW/DEN, lo que sugiere claramente que la sobrecarga de lípidos actúa como un promotor tumoral. Uno de los componentes clave de la dieta occidental es el colesterol alto. Nosotros y otros hemos publicado que este lípido, además de las propiedades fundamentales bien reconocidas para la vida, muestra efectos nocivos cuando se acumula excesivamente en las células, particularmente como resultado de la disfunción mitocondrial y el deterioro de la transducción de señales al alterar la fluidez de la membrana celular. Cuando se acumula en el hígado, demostramos previamente que el colesterol aumenta definitivamente la carga tumoral y la agresividad. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos por los cuales el colesterol favorece el desarrollo de tumores aún no se conocen por completo. El análisis transcriptómico realizado por RNA-seq muestra una buena separación entre los grupos CW/DEN y HC/DEN, W/DEN. Un análisis de GSEA reveló un fenotipo inflamatorio notable, particularmente impulsado por la señalización de IL-6/STAT3, además de otras vías relacionadas con factores de crecimiento como HGF, incluidas las vías PI3K/AKT y ERK. Es muy interesante la abrogación de señales supresoras de tumores clave como p53, PTEN y la señalización de apoptosis en este modelo. Nuestro trabajo anterior identificó un notable efecto mecanicista inducido por la sobrecarga de colesterol en el hígado, incluida la regulación a la baja de las principales proteínas reparadoras del DNA, como ATM, ATR, CHK1 y 2 y p53. Mediante un análisis utilizando el software IPA, confirmó este efecto en términos de vías de señalización controladas por p53. Desde principios de los años 2000, algunos informes señalaron la represión transcripcional de p53 por STAT3. La pérdida de función de p53 también se ha relacionado con la activación de STAT3 en el cáncer de páncreas. Nuestro trabajo publicado anteriormente informó que la sobrecarga de colesterol en el hígado de ratones alimentados con una dieta alta en colesterol durante 30 días presentó una activación notable de Stat3 y el incremento en la expresión de genes diana clave como Mcl-1. Está claro que el colesterol toma el control de estas vías de señalización relevantes en preparación para la promoción de tumores. Por el contrario, se ha observado que la desfosforilación de STAT3 podría estabilizar p53 y conducir a la apoptosis. De acuerdo con el análisis de RNA-seq, encontramos escasa supervivencia. Las principales citocinas y factores de crecimiento asociados a la proliferación e inflamación (por ejemplo, IL-6, IL-17, HGF, VEGF-A, entre otros) estaban significativamente elevados en ratones en tratamiento con W/DEN. Inmunofluorescencias de F4/80 y CD206 corroboraron una significativa infiltración inflamatoria en los animales alimentadós con dietas altas en colesterol en comparación con CW/DEN tumoral, lo cúal identificamós una vez más a STAT3 como un factor clave en la inflamación de NASH y HCC. La modulación de la respuesta inmune que promueve el reclutamiento y la activación de macrófagos ha sido reportada previamente en tumores criados bajo el consumo de dietas altas en lípidos/colesterol. El estrecho contacto de los macrófagos y las células tumorales se asocia a la polarización de los macrófagos tipo M2 aumentando la agresividad de los tumores. De acuerdo con estos hallazgos anteriores, observamos una señal prominente de F4/80 y CD206 en dietas altas en lípidos, particularmente en la dieta occidental. Curiosamente, se ha observado que los macrófagos M2 podrían proporcionar colesterol a las células tumorales, creando una codependencia del colesterol entre estas células en el microambiente tumoral. La infiltración alta de macrófagos M2 se asocia con una supervivencia más pobre y un aumento en la recurrencia del cáncer. Además de una infiltración de macrófagos bien definida, también observamos un aumento en la respuesta proangiogénica, juzgado por el incremento en la expresión de VEGF-A y HGF, y confirmado por la detección deCD34, lo que apoya el fenotipo agresivo. En consecuencia, informamos que la firma de expresión regulada por HGF/c-Met se asoció con un incremento en la angiogénesis y fue capaz de definir un subtipo de HCC humano con mal pronóstico y fenotipo agresivo. Otra característica observada en esta firma fue la destacada descompensación de la lipogénesis y el estrés oxidativo. Por lo cual decidimos develar algunos de los mecanismos por lo cual HGF/c-Met regula el estado redox celular. Como se muestra en el Anexo II, Es bien sabido que la señalización mediada por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y su receptor c-Met en el hígado está involucrada en el control del estado redox celular y el estrés oxidativo, particularmente a través de su capacidad para inducir la expresión de genes hepatoprotectores activando vías de supervivencia. Se ha informado de que el HGF puede regular la expresión de algunos miembros de la familia de la NADPH oxidasa en las células hepáticas, en particular las subunidades catalíticas y p22phox. Por lo que nos centramos en caracterizar el mecanismo de regulación de p22phox por HGF/c-Met en hepatocitos primarios de ratón como un determinante clave para la regulación redox celular. Los hepatocitos primarios de ratón se trataron con HGF (50 ng/ml) durante diferentes tiempos. La expresión de cyba (gen que codifica p22phox) o el contenido de proteínas se abordaron mediante RT-PCR en tiempo real, Western blot o inmunofluorescencia. Las interacciones proteicas se exploraron mediante inmunoprecipitación y análisis FRET. Nuestros resultados proporcionaron información mecanicista que apoya la represión transcripcional de cyba inducida por HGF en un mecanismo dependiente de la actividad de NF-kB. Identificamos un mecanismo de regulación postraduccional dirigido por la degradación de p22phox por el proteasoma 26S, y un segundo mecanismo mediado por el secuestro de p22phox por c-Met en la membrana plasmática. Nuestros datos muestran claramente que HGF/c-Met ejerce la regulación de la NADPH oxidasa por una amplia gama de mecanismos moleculares. Las especies reactivas de oxígeno derivadas de la NADPH oxidasa reguladas por HGF/c-Met representan uno de los principales mecanismos de transducción de señales provocadas por este factor de crecimiento. Para obtener una evidencia más mecanicista de la relevancia del desarrollo de tumores en hígados sobrecargados de lípidos, estudiamos otro grupo de ratones alimentados con una dieta alta en colesterol (carbohidratos y otros lípidos en contenido estándar). El análisis de expresión génica en este proceso tumorigénico identificó 194 genes expresados diferencialmente relacionados con CW/DEN. La comparación entre HC/DEN y W/DEN identificó 62 genes comúnmente regulados. Respaldando estos hallazgos, establecimos una genómica comparativa entre los tumores de ratones con alto colesterol y los HCC humanos, donde identificamos 62 genes compartidos por W/DEN y HC/DEN, los culaes tienen relevancia clínica y se asocian con un mal pronóstico en los HCC humanos. Se necesitarán más investigaciones para establecer completamente la contribución de cada gen específico. Incluidos cuatro genes (Slc41a3, Fabp5, Mthfd1l e Igdcc4) con relevancia clínica en la carcinogénesis humana. Estos genes están elevados en las muestras de HCC y se asocian a una baja supervivencia de los pacientes. El gen Slc41a3 está relacionado con la actividad del transportador transmembrana de cationes. Impulsa la salida de Mg2+ particularmente en las mitocondrias. Se ha informado que la sobreexpresión de Slc41a3 en el cáncer puede ser utilizadó para el transporte de nutrientes y Mg2+ para satisfacer las necesidades de proliferación y metabolismo aberrante presente en las células de cancer. Como se ha dicho, las mitocondrias son quizás el organelo más relevante en la célula sobrecargada de colesterol. La sobreexpresión de este sistema transportador podría estar dirigida a compensar la pérdida de fluidez en las mitocondrias, mejorando la extrusión de Mg2+. Fabp5 codifica la proteína de unión a ácidos grasos 5 (Fabp5). Esta proteína se ha relacionado con el potencial maligno en varios cánceres, incluido el HCC. La tinción positiva de FABP5 en HCC se asocia con mal pronóstico, recurrencia, metástasis e invasión. FABP5 transporta lípidos intracelularmente con fines de almacenamiento, proporcionando bloques de construcción para la construcción de membranas y suministro de energía, ambos muy necesarios en las células en proliferación. Igdcc4 para la proteína Nope. Es un marcador de células progenitoras, inicialmente identificado en el hígado fetal murino. Anteriormente se ha demostrado que Nope es un marcador confiable de HCC asociado a stemness. Si bien, Nope se detecta escasamente en hepatocitos adultos, el daño podría inducir la expresión, particularmente en el daño colestásico que se asocia a cambios en la polarización de los hepatocitos. Se ha demostrado que la proteína Nope es un marcador bueno y confiable para el HCC en la clínica porque podría detectarse altamente en tumores AFP positivos y negativos. Mthfd1l, codificada por el gen Mthfd1l es una enzima del ciclo del folato. Está involucrado en la generación de formiatos, por lo tanto, en el metabolismo de compuestos monocarbonado, fundamental utilizados en la síntesis de purinas y en la síntesis de proteínas. Por tanto, esta enzima es muy relevante en los tejidos en proliferación, especialmente en el cáncer. La expresión de Mthfd1l se ha asociado con un mal pronóstico, sobre todo en el HCC. Nuestra firma genetica propuesta indica claramente una adaptación metabólica, comprometiendo la adaptación mitocondrial y la participación de los macrófagos, particularmente la polarización tipo M2 en un proceso inducido e impulsado por la sobrecarga de colesterol. En conclusión, el consumo de dietas enriquecidas con lípidos, en particular colesterol, podría favorecer el desarrollo de HCC con un fenotipo agresivo y de mal pronóstico.
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