Evaluación Fisicoquímica de Mutantes Termorresistentes de la β-glucosidasa B de Paenibacillus polymyxa - Camarillo Cadena, Menandro (Universidad Autónoma Metropolitana, 2011)
En el presente trabajo se realizó una caracterización funcional, estructural y energética de diversas mutantes de la enzima β-glucosidasa B (βglB) proveniente de la bacteria Paenibacillus polymyxa. Como un prerrequisito para los estudios de estabilidad, se determinó que la enzima silvestre se desnaturaliza térmicamente a través del denominado mecanismo de Lumry-Eyring (N ↔ D → I) y que a temperaturas altas, superiores a Tm, la energía de activación solo involucra la etapa elemental de desnaturalización (N→D). Las mutantes estudiadas se generaron previamente con la intención de producir variantes termorresistentes de la enzima βglB en dos procesos independientes: I) Mutaciones por evolución dirigida (MED) (tres mutantes puntuales: H62R, N223Y, M319I y una triple, TM, H62R/N223Y/M319I) y II) Mutaciones de carga (MDQ) para minimizar la energía electrostática de la proteína solvatada (A91R, A112R, A238R y V323R). Se determinó la estabilidad térmica de las mutantes a través de cinéticas de desnaturalización a diferentes temperaturas. Todas las mutantes de βglB mostraron ser activas y con una eficiencia catalítica semejante y en algunos casos inclusive mayor a la enzima silvestre. Ninguna de las mutantes mostró diferencias significativas en sus espectros de fluorescencia intrínseca y dicroísmo circular en el UV lejano en relación a los de la enzima silvestre, por lo que las mutaciones analizadas no generaron cambios estructurales importantes. Se cuantificaron los cambios energéticos en la barrera de activación (energía libre de Gibbs, N ET G →∆ ), mediante la determinación de las constantes de desnaturalización térmica, kd, siguiendo el proceso cinético por dicroísmo circular de todas las mutantes. Los incrementos en la barrera activación para la desnaturalización de las mutantes sencillas H62R, N223Y y M319I del grupo MED, muestra un efecto aditivo ( N ET TMG →∆ = Σ N ET puntual temuG →∆ tan , ) en la TM (H62R/N223Y/M319I). De las cuatro mutantes de carga (MDQ) solo una presentó un aumento en la barrera de activación de alrededor de 1.0 kJ mol-1, dos de ellas mostraron una estabilidad similar a la de la enzima βglB silvestre, mientras que la V323R mostró una disminución de 4.0 kJ mol-1