Identificación de una lacasa de Pleurotus ostreatus predominante en condiciones de fermentación líquida y caracterización molecular del gen que la codifica - Téllez Téllez, Maura (Universidad Autónoma Metropolitana, 2011)
Las lacasas (EC 1.10.3.2) son glicoproteínas clasificadas como oxidasas multicobre que catalizan la oxidación de varios compuestos orgánicos e inorgánicos, acopladas a la reducción del oxigeno molecular en agua. Las lacasas catalizan la remoción de un átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo de monofenoles metoxilados, orto y para- difenoles. También pueden oxidar otros sustratos como aminas aromaticas, siringaldazina y compuestos no fenólicos, formando radicales libres. Están reguladas por varios factores como son pH, temperatura e iones, entre otros. Las lacasas de Pleurotus ostreatus están siendo ampliamente estudiadas, se han reportado hasta ahora seis isoenzimas complemente caracterizadas (propiedades fisicoquímicas y secuencia); sin embargo, existen isoenzimas de las cuales se conoce su secuencia pero no su estructura proteica y aun faltan isoenzimas por describir. En este trabajo se describe una nueva isoenzima de P. ostreatus. Se analizaron las isoenzimas de lacasas producidas por fermentación en medio líquido (FML) y fermentación en medio sólido (FML) sobre espuma de poliuretano (PUF), el medio de cultivo fue suplementado con cobre. Se obtuvo mayor biomasa y actividad de lacasa en la FML comparado con la FMS (5.5 g/L de biomasa con 13000 U/L de lacasa y 5 g/L de biomasa con 2400 U/L, respectivamente). La FML presentó hasta cuatro isoenzimas de lacasas y en la FMS únicamente se presentaron tres. La actividad de proteasas se observó sólo en la FMS y en ambos sistemas de fermentación se agotaron los azúcares. Una isoenzima producida por FML se presentó durante todo el tiempo de fermentación, la cual reportó un peso molecular aparente menor a los ya reportados (54.1 kDa). Se obtuvo la secuencia del amino terminal y a partir de esa secuencia se obtuvo el gen que codifica para la isoenzima de lacasa de interés de P. ostreatus. La secuencia del promotor constó de 469 pb, presentó posibles factores transcripcionales como MRE (cuatro), XRE (tres), uno de respuesta de defensa y un elemento de repuesta al estrés. El gen presentó un tamaño de 2636 pb interrumpido por 16 intrones, la secuencia que codifica para la proteína (RNAm) constó de 1527 pb. El gen de lacasa aislado codificó para una proteína de 509 aminoácidos y 22 aminoácidos que corresponden al péptido señal. En el análisis mediante el programa BLAST (NCBI) de la secuencia de la proteína derivada del gen de lacasa presentó alrededor de un 96-97% de semejanza con las lacasas de Pleurotus reportadas en el banco de genes (NCBI), el gen completo presentó semejanzas de entre un 86 y un 94%, al igual que el ARNm. A pesar de que la similitud es alta, presenta características tales como peso molecular (SDS-PAGE), afinidad de sustratos y el promotor diferentes a los ya reportados.; Laccases (EC 1.10.3.2) are glycoproteins classified as multi–copper oxidases, which catalyze one electron oxidation of a wide range of inorganic and organic substances, coupled with reduction of oxygen to water. Laccases catalyze the removal of a hydrogen atom from the hydroxyl group of methoxy-substituted monophenols, ortho- and para-diphenols, and also can oxidize other substrates such as aromatic amines, syringaldazine, and non-phenolic compounds, to form free radicals. Laccases are regulated by several factors such as pH, temperature, ions, etc. Laccases from Pleurotus ostreatus have been widely studied; there are reports of characterization of six isoenzymes (protein sequence and gene coding sequence), however, there are some isoenzymes not characterization yet. In this research, I describe a new laccases isoenzyme from P. ostreatus. Presence of isoenzymes of laccase in submerged fermentation (SmF) and solid-state fermentation (SSF) using polyurethane foam (PUF) as support was evaluated. The culture media were added of copper. The biomass and de laccase activity were higher in SmF than SSF (5.5 g/L of biomass and 13000 U/L of laccase activity, and 5 g/L and 2400 U/L respectively). Four isoenzymes of laccase were observed in SmF and three in SSF. Proteases activity was only observed in SSF. The carbohydrates consumption was total in both fermentation systems. It was observed a laccase isoenzyme through out the fermentation time in SmF with an apparent molecular weight less than the cues previously reported (54.1 kDa). The amino terminal sequence was obtained based on it was the gene coding sequence (3102 bp). The promoter region sequenced (469 bp upstream of ATG) contained putative binding transcription factors such as MRE (four), XRE (three), defense response element (one) and stress response element (one). The gene contains 2636 bp, interrupted by 16 introns, the protein coding sequence (mRNA) contains 1527 bp. The encoded protein contained 509 amino acids. The protein and gene sequences showed a 96-97% and 86-94 % of similarity with laccases of Pleurotus those previously reported (BLAST, NCBI). Although the similarity is high, this laccase isoenzyme has different characteristics such as apparent molecular weight (SDS- PAGE), affinity for substrates and the promoter sequence, from those already reported.