Producción de taxol y taxanos relacionados en cultivos de células en suspensión de Taxus globosa (Schltdl) Público Deposited

Los cultivos de callos cultivados en los dos medios (B5 y WPM) produjeron taxol y 3 taxanos entre ellos: la baccatina III, 10-deacetilbaccatina III y 10-deacetiltaxol; estos taxanos se producen desde el inicio de los cultivos y hasta el final de los mismos en forma cíclica, obteniendo la mayor producción de taxol en el medio B5 durante la 1ª semana (50 µg/g PS) de cultivo, esta producción fue el doble y se obtuvo en menor tiempo que en el medio WPM (24 µg/g PS). Los cultivos de células en suspensión se establecieron a partir de callos friables derivados de hojas de T. globosa. Se realizaron los experimentos para determinar el tamaño de inóculo más adecuado para esta especie (50, 100 y 150 g PF/L), donde se determinó que el tamaño de inóculo de 50 g PF/L fue el adecuado para establecer las cinéticas de crecimiento celular en medio WPM, en los cultivos tipo lote de células en suspensión de T. globosa y se obtuvo un IC de 0.65 y un td 3.9 días. En el establecimiento de los cultivos tipo lote de celulas en suspensión se evaluaron los medios WPM y B5 añadidos de PIC (2 mg/L), CN (0.1 mg/L) y GA₃ (0.5 mg/L) y la estimulación con jasmonato de metilo (MeJ) (100µM). El medio que estimuló el crecimiento celular fue el WPM con un IC de 6.14 y un td de 2.32 días. El medio de cultivo WPM añadido de MeJ estimuló la producción del taxol (197.999 µg/L) y tres taxanos más como son 10-deacetilbaccatina III (633.724 µg/L), 10-deacetiltaxol (229.611 g/L) y baccatina III (160.622 µg/L). En base a los resultados obtenidos en la evaluación de los medios WPM y B5, donde observamos que el WPM estimuló el crecimiento celular y por otro lado, el medio B5 estimuló la excreción de los taxanos al medio de cultivo, se decidió evaluar por primera vez en cultivos líquidos de T. globosa, la estrategia de cultivos tipo lote en dos fases y la estimulación con calcio (Ca²⁺) y MeJ. En esta etapa se corroboró que el MeJ inhibe el crecimiento celular en los cultivos de T. globosa. Con respecto a la producción de los taxanos, observandose que el efecto del Ca2+ combinado con el MeJ incrementó la productividad de 3 taxanos: taxol (16.299 – 34.516 µg/L día⁻¹ ), baccatina III (4.673 – 26.287 µg/L día⁻¹ ) y cefalomanina (2.435 – 151.995 µg/L día⁻¹ ) con una excreción de 41 al 60 %, con esta estrategia biotecnológica no se logró estimular la producción del 10-deacetiltaxol.

En la última etapa del trabajo de investigación, se evaluó por primera vez en los cultivos celulares del tejo mexicano, el efecto de la inmovilización celular y la estimulación con MeJ (100 µM), en medio Gamborg B5 (B5) añadido de dos tratamientos que contenían 2,4-D (T1) y PIC (T2), en combinación con CN y benzilaminopurina (BAP). Para ello se empleó los cultivos tipo lote en dos fases, con la finalidad de estimular en la segunda fase o de producción, la biosíntesis de los taxanos con respecto al factor tiempo, así como su excreción en los cultivos celulares de T. globosa. La productividad y el porcentaje de excreción al medio de cultivo de 4 taxanos: baccatina III (8.260 – 12.7888 µg/L día⁻¹ )( 81%); 10-deacetilbaccatina III (15 µg/L día⁻¹); 10 deacetiltaxol (3.180 µg/L día-1 )( 62%) y cefalomanina (49.272 µg/L día⁻¹ ), se estimuló principalmente, por efecto del tratamiento T1 en los cultivos de células libres y estimulados con MeJ, a partir del tercer día y hasta al final de la segunda fase de la cinética. Por el contrario, la productividad del taxol (53 µg/L día-1 ) se obtuvo por efecto del tratamiento T2 añadido de MeJ de manera intracelular tanto en células libres como inmovilizadas, el tiempo de la biosíntesis in vitro del taxol disminuyó de 15 días a 3 días en fase de producción, incrementando al doble su productividad (130.347 µg/L día-1 ) en los cultivos de células inmovilizadas y estimuladas con MeJ de T. globosa. Nuestros resultados indican que para estimular la producción de los precursores del taxol (baccatina III y 10-deacetilbaccatina III) además de la cefalomanina y el 10-deacetiltaxol, no es necesario inmovilizar los cultivos de células en suspensión de la especie. Asimismo, la velocidad de biosíntesis del taxol in vitro se incrementó por efecto de la inmovilización celular y del estímulo del jasmonato de metilo en sinergia con las fuentes de carbono utilizadas en esta investigación.

Taxus globosa Schltdl. (Taxaceae) “tejo mexicano”, es la única especie del género Taxus que crece en la República Mexicana. Por la rareza de la especie, por su lento crecimiento y poca densidad poblacional, es un árbol protegido por la Secretaria del Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT). El árbol silvestre de T. globosa ha sido estudiado desde el punto de vista fitoquímico desde 2000 a la fecha, demostrando que la especie produce taxol y taxanos relacionados con importante actividad anticancerígena, a diferencia de otras especies de Taxus, la mayor acumulación de taxol ocurre en las hojas y en los tallos jóvenes. Objetivo. Dada la importancia de su potencial biosintético con respecto a la producción de taxanos bioactivos, se iniciaron los cultivos in vitro de T. globosa, para evaluar diferentes estrategias biotecnológicas como son: el tipo de cultivo, formulación del medio de cultivo, cultivo tipo lote y cultivo en dos fases, el uso de estimuladores e inmovilización celular, con la finalidad de incrementar la producción de taxol y taxanos relacionados y estimular su excreción al medio de cultivo. Resultados. Se realizaron los experimentos de establecimiento de los cultivos de callo y células en suspensión, donde se obtuvieron callos derivados de hojas y tallos jóvenes de T. globosa a partir del tiempo 20 días en medio Gamborg (B5) añadido de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) (2 mg/L), cinetina (CN) (0.5 mg/L) y ácido giberélico (GA₃) (0.25 mg/L). El crecimiento y la producción de taxanos en cultivos de callo se evaluó en dos medios de cultivo: Woody Planta Medium (WPM) y B5 añadidos de picloram (PIC) (2 mg/L), CN (0.1 mg/L) y GA₃ (0.5 mg/L). Los callos cultivados en medio B5 presentaron un índice de crecimiento (IC) de 0.44 y un tiempo de duplicación (td) de 13.81 días. Por otro lado, los callos cultivados en medio WPM tuvieron mayor IC (0.70) y un td de 13.2 días.

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