Producción e identificación molecular de quitina desacetilasas en hongos fitopatógenos - Muñiz Paredes, Facundo Rafael (Universidad Autónoma Metropolitana, 2012)
Las quitina desacetilasas (CDA) juegan un papel importante en el desarrollo de la pared celular y las interacciones planta-patógeno. Su acción es hidrolizar los enlaces N- acetamida de la quitina y producer su derivado desacetilado (quitosano). A pesar de los reportes de purificación de CDAs de hongos como Mucor rouxii, Absidia coerulea y Colletotrichum lindemuthianum, no existe información sobre la producción de Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum acutatum y Fusarium solani. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la producción de CDAs de C. gloeosporioides, C. acutatum y F. solani en cultivo liquido (CL) y cultivo sólido (CS). Por otra parte, tuvimos el interés de identificar molecularmente los genes CDA. Las cinéticas de actividad CDA en CL y CS (usando espuma de poliuretano (PUF) como soporte inerte) fueron llevadas a cabo utilizando un medio a base de ácido glutámico y glucosa. Las actividades CDA de los extractos crudos enzimáticos de C. gloeosporioides, C. acutatum y F. solani fueron determinadas espectrofotométricamente. Se realizó microscopia electrónica de barrido (SEM) con el fin de observar estructuras infectivas. La identificación molecular de los genes fue realizada por PCR usando oligonucleótidos diseñados en regiones consenso encontradas en genes CDA de C. lindemuthianum y Magnaporthe grisae reportados en Genebank. C. gloeosporioides mostro actividad CDA en ambos tipos de cultivos, pero la actividad CDA fue mayor en CL que en CS. C. acutatum y F. solani solo presentaron actividad cuando fueron cultivados en CS, pero estas actividades fueron menores a aquellas obtenidas con C. gloeosporioides en CL. La producción de CDAs con C. acutatum y C. gloeosporioides en CS no fue significativamente diferente (α≤0.05). La caracterización microscópica mostró macrosesporas de C. gloeosporioides, C. acutatum y F. solani con longitud y morfología típica. C. gloeosporioides y F. solani solo mostraron desarrollo de apresorios en CS; mientras que C. acutatum desarrolló apresorios tanto en CS como CL, se sabe que a la formación de apresorios es seguida la producción de CDAs en algunos hongos y son estructuras infectivas, lo cual podría explicar la falta de actividad CDA en F. solani; y en C. acutatum la falta de actividad CDA podría tratarse de un efecto de represión catabólica que se manifiesta de manera evidente en CL. Tanto C. acutatum como C. gloeosporioides fueron seleccionados para la identificación molecular de los genes CDA, la secuenciación de la banda B1 de C. acutatum mostro una máxima identidad del 84% y del 98% a un gen CDA de C. lindemuthianum usando las herramientas BLAST y TBLASTX, respectivamente, mientras que la banda B2 de C. gloeosporioides mostro un 75% de máxima identidad a un gen CDA de M. grisea (BLAST) y un 71% de máxima identidad a una polisacárido desacetilasa de C. graminícola (BLASTX).