Efecto de los estímulos del medio sólido: contacto directo con el aire y estímulo del soporte, en la producción de lovastatina por Aspergillus terreus - Pérez Sánchez, Ailed (Universidad Autónoma Metropolitana, 2014)
La producción convencional de lovastatina y otros metabolitos secundarios se ha llevado a cabo mediante la FL, sin embargo en años recientes, los investigadores han mostrado un creciente interés por la FS, como una alternativa a la FL. Lo anterior debido a que se pueden utilizar sustratos económicos, se requiere poco procesamiento y se utiliza menos potencia. Un factor muy importante es que presentan altas productividades y rendimientos generalmente más altos que en FL. Además, existen metabolitos secundarios que sólo pueden producirse en FS, a pesar de que el hongo productor también crece en FL Otras ventajas que presenta la FS es la baja actividad del agua, que ayuda a evitar las contaminaciones además de que genera menos efluentes. La FS se caracteriza también por poder utilizar altas concentraciones de sustrato que permite utilizar reactores más pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de fermentación, debido a todas estas ventajas la FS es un método de cultivo alternativo que se ha vuelto cada vez más atractivo para la investigación y para la industria. A pesar de que las principales ventajas de La FS provienen de un comportamiento diferente al presentado en FL, la fisiología especial que presentan los microorganismos en FS no está bien caracterizada, aunque ya se ha acuñado el término de fisiología del medio sólido. De hecho, son poco conocidos los estímulos que el hongo percibe al encontrarse en medio sólido, y que inducen una fisiología diferente. La FS presenta diferencias significativas con la FL, la más importante y la más atractiva es la sobreproducción que presenta de enzimas y metabolitos secundarios. Sin embargo para poder aplicar y desarrollar sistemas de fermentación que aprovechen las particularidades de la FS es necesario comprender qué estímulos son los que propician las altas producciones además de las diferencias fisiológicas que surgen durante el crecimiento de células microbianas en los dos tipos de sistemas de cultivo. En un trabajo anterior del grupo se identificó al contacto directo con el aire como el estímulo de más impacto en la producción de lovastatina, y en segundo lugar a los estímulos generados por el soporte. En otro trabajo previo del grupo, se encontró una acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs) durante la idiofase en ambos sistemas de cultivo. Más tarde, se demostró que las EROs regulan, a nivel transcripcional, los genes de lovastatina, encontrando que estos niveles eran más bajos y más constantes en FS. Esos niveles de EROs estaban aparentemente relacionados con el estímulo de contacto directo con el aire en FS. Quedaba la pregunta de cómo incide el nivel de aireación en FS sobre este la acumulación de EROs. Esta tesis se dedicó al estudio de estímulos de la FS: contacto directo con el aire y del soporte, así como a la aplicación de estos en FL. También se estudió el mecanismo por el que las EROs regulan la producción de lovastatina en A. terreus. Esto se realizó a través del silenciamiento de uno de los factores transcripcionales de respuesta a estrés oxidativo. En el presente trabajo se estudio cómo la aireación influye en la acumulación de EROs, demostrándose que la forma general del perfil de acumulación de EROs, en la FS de lovastatina, es independiente del grado de aireación. Además se estudió este efecto en diferentes tipos de FS: en soporte inerte artificial (espuma de poliuretano) y soporte inerte natural (bagazo de caña). También en el soporte más utilizado en la industria, que es FS en sustrato sólido (salvado de trigo). Los resultados demostraron que, en cualquier sistema de FS (en soporte inerte o en sustrato sólido), a mayor nivel de aireación hay una menor acumulación de EROs, con lo que se obtiene una menor producción de lovastatina, pero una mayor generación de biomasa. Otro aspecto que este trabajo abordó fue el estudio de la adición, en la FL, de estímulos de la FS: el soporte, el contacto con el aire y la adición de peróxido de hidrogeno (Agente oxidante). Se comprobó que éstos logran inducir en cierto grado, la fisiología del medio solido provocando un aumento en la producción de lovastatina en la FL. En la adición de soporte a la FL se demostró que la cantidad de biomasa en el cultivo líquido depende de la cantidad de soporte que se añade. También se encontró que a menor tamaño de partícula de soporte utilizada, se obtiene una mayor cantidad de biomasa y por lo tanto una mayor producción de lovastatina (volumétrica). Cabe destacar que en todos las condiciones (o sistemas) ensayados de soporte en FL, la producción específica fue muy superior (de 49 - 88 g/mg biomasa) a la encontrada en FL (29 g/mg biomasa), lo cual indica un cambio en la fisiología. En cuanto a la producción volumétrica, todos los sistemas, excepto uno, mostraron una mayor producción que la de FL (de 537 a 1,195 g/mL. El que produjo menos, fue ligeramente menor que el control de FL, pero fue el que tenía muy poca cantidad de soporte (1B) por lo que sólo se produjo un tercio de la biomasa del control. Por otro lado, con la adición de peróxido de hidrógeno a la FL se logró adelantar la acumulación de EROs y en consecuencia adelantar la biosíntesis de lovastatina. Esto confirma que las EROs regulan la biosíntesis de lovastatina. Debido al papel que juegan las EROs en la fisiología de los organismos como segundos mensajeros en las vías de transducción de señales, en la presente tesis se consideró que Yap1p puede ser el nexo entre las EROs y los genes de lovastatina. Para evaluar esta hipótesis, se silenció el gen atyap1, a través de un sistema de RNAi, que ha demostrado ser una herramienta rápida y efectiva para suprimir la expresión de un gen de interés. El silenciamiento del gen atyap1 provocó: la disminución de la expresión del gen atyap1, pero también la de sod1. Esto ocasionó el Inicio precoz e incremento en la acumulación de EROs. Así, la cepa silenciada (Δatyap1) presentó sensibilidad a estrés oxidativo, el adelanto e incremento de la expresión del gen lovE, y el inicio precoz e incremento en la producción de lovastatina debido a que produce, aunque a una tasa similar, pero por más tiempo. Resulta importante que la cepa Δatyap1 mostró un incremento en la producción de lovastatina de 70 % en FS y también 60 % en FL. Esto demuestra que Yap1 (AtYap1) no es un regulador positivo de los genes de lovastatina. Por otro lado, el adelanto en la acumulación de EROs también adelantó e incrementó la expresión de brlA, lo cual ocasionó el inicio precoz y un aumento importante de la esporulación. Esto siguiere que Yap1 podría estar actuando como un regulador negativo de lovE y los genes de biosíntesis, así como de brlA (y así a los genes relacionados con la esporulación) en A. terreus. Pero regula positivamente a los genes que combaten la acumulación de EROs como sod1. Así, el factor transcripcional Yap1p podría ser el nexo entre las EROs y la lovastatina. Sin embargo, también es posible que esto sea un efecto indirecto debido a la acumulación prematura de EROs, induciendo la lovastatina por medio de otro factor transcripcional de respuesta a estrés oxidativo. Con estos resultados se obtuvo una visión más amplia e integrada de la fisiología del medio sólido, e incluso parte de la fisiología y mecanismos moleculares en medio líquido que no se conocen.; The conventional production of lovastatine and other secondary metabolites has been carried out through submerged fermentation (SmF), however in recent years; researchers have demonstrated a growing interest for solid-state fermentation (SSF), as an alternative for SmFL. This is because more economic substrates can be utilized, little processing is required and it requires less power. A very important factor is that SSF have high productivities and yields generally higher than in SmF. In addition, there are secondary metabolites that can only be produced in SSF even though the fungus that produces them also grows on the SmF. Other advantages that the SSF presents are the low water activity, which helps avoid the contaminations and it also generates less effluent. The FS is also characterized for its ability to utilize high concentrations of substrate that permits the use of smaller reactors in comparison with the ones utilized in other types of fermentation, due to all of these advantages SSF is an alternative method of cultivation that every time has become more attractive to investigation and the industry. Even though that the principal advantages of the SSF come from a different behavior presented in SmF the special physiology that the microorganisms present in SSF is not well characterized, even though it has been coined the term of physiology of the solid medium. Actually, there are few stimuli that the fungus perceives when found in a solid medium and that induce a different physiology. The SSF has the most important differences with SmF, and the most attractive features are the overproduction of enzymes and secondary metabolites. However to implement and develop fermentation systems that exploit these features of the SSF is necessary to understand what are the stimuli that promote high yields in addition to the physiological differences that arise during the growth of microbial cells in both types of culture systems. In a previous work of the group direct contact with air was identified as the environmental factor with more impact on the production of lovastatin, and secondl, the stimuli generated by the support. In a previous work of the group, an accumulation of reactive oxygen species (EROs) was found during the idiofase in both culture systems. Later, it was demonstrated that EROs regulate, at the transcriptional level, lovastatin genes, finding that these levels were lower and more constant in SSF. These levels of EROs were apparently related to the stimulus of direct contact with the air in SSF. There remained the question of how is this this EROs accumulation affected by the level of aeration in SSF. This thesis has been dedicated to the study of stimuli of the SSF:: direct contact with air and the support, just as the application of these in SmF.. We also studied the mechanism by which ROS regulate the production of lovastatin in A. terreus. This was accomplished through the silencing of one of transcriptional factors of oxidative stress response. We also studied how the aeration influences the accumulation of EROs demonstrating that the overall shape of the profile of accumulation of EROs, in the SSF of lovastatine, is independent of the degree of aeration. This effect was also studied in different types of SSF: Artificial inert support (polyurethane foam) and natural inert support (bagasse). Also I used the FS is in solid substrate (wheat bran). The results showed that, in any SSF system at greater levels of aeration there are lower levels of EROs, and lower yields of lovastatine ,are obtained, but a greater generation of biomass. Another aspect of this work was the study of the addition of stimuli of SSF to SmF: support, contact with the air and the addition of peroxide (EROs). It was found that they induce a certain degree of the physiology of solid medium, causing an increase in the production of lovastatin in SmF. In relation to adding support to the SmF, it was shown that the amount of biomass in the liquid culture depends on the amount of support. We also found that the smaller particle size of the support used, the larger the amount of biomass obtained, and therefore a higher production of lovastatin (volumetric). It is noteworthy that in all conditions (or systems) tested (support in SmF), the specific production was quite superior (of 49-88 g / mg biomass) in relation to the one found in SmF (29 g/mg biomass), which indicates a change in the physiology. Regarding the volumetric production, all systems, except one showed higher yield than the control (from 537 to 1,195 g / ml). The one which produced less, was slightly lower than the control SmF, but it was the one that had very little support (1B) so there was only a third of the biomass of control. On the other hand, with the addition of peroxide of hydrogen to the SmF, EROs were accumulated earlier and as a result premature biosynthesis of lovastatine. was obtained This confirms that the EROs regulate the biosynthesis of lovastatine Due to the role carried out by the EROs as second messengers in signal transduction pathways, in this thesis it was found that Yap1p may be the link between ROS and genes of lovastatin. To test the hypothesis, the Yap1 gene was silenced through RNAi system, which has proven to be a fast and effective to suppress the expression of the gene of interest. Yap1 silencing provoked: decreasing yap1 gene expression, but also the sod1 gene.. This caused an early start and increased accumulation of ROS. Thus, the silenced strain (Δatyap1) showed sensitivity to oxidative stress, premature and increased gene expression of lovE and early onset and increased lovastatin production.. It is important that the strain Δatyap1 showed increase in the production of lovastatine of 78% in FS, and also 78% in FL. On the other hand, this premature accumulation of EROs also caused an early and increased d expression of brlA which caused the early initiation and significant increment in sporulation. This suggests that Yap1 could be acting as a negative regulator of lovE and biosynthestic genes, as well as brlA (and thus genes related to sporulation) in A. terreus. But positively regulating the genes that combat the accumulation of EROs like sod1. Thus, the transcription factor Yap1p might be the link between ROS and lovastatin. However, it is also possible that this is an indirect effect due to the premature accumulation of ROS, inducing lovastatin through another transcriptional factor in response to oxidative stress. With these results, a more comprehensive and integrated physiology of vision solid medium, and even part of the physiology and molecular mechanisms in liquid medium that are unknown.