Caracterización molecular de proteasas termoestables producidas por Aspergillus fumigatus - Hernández Martínez, Ricardo (Universidad Autónoma Metropolitana, 2011)
Actualmente el interés en la producción de enzimas termoestables se ha incrementado debido a la diversidad de aplicaciones y beneficios industriales que representan. El objetivo de la presente investigación fue la caracterización de los factores bioquímicos responsables de la termoestabilidad de proteasas fúngicas producidas por Cultivo en Medio Sólido (CMS). El trabajo se inicio seleccionando los hongos y levaduras capaces de crecer a 45°C, en esta etapa se seleccionaron 29 de 72 cepas. En una segunda etapa, se seleccionaron las cepas (2.2 aB, 2.7 aB y 36 aIV) productoras de proteasas en agar leche descremada. Posteriormente se evaluó la producción de proteasas en CMS con las cepas seleccionadas, las cepas 2.2 aB y 36 aIV alcanzaron la máxima actividad a las 36 h de cultivo, mientras que la cepa 2.7 aB requirió 48 h para alcanzar la máxima producción, misma que fue 45% menor que las cepas antes mencionadas, motivo por cual fue descartada. Los extractos enzimáticos producidos por las cepas 2.2aB y 36 aIV presentaron pH y temperatura óptimos de actividad de 9 y 7 respectivamente, a 50°C. El extracto producido por la cepa 2.2 aB presentó un tiempo de vida media (t1/2) de 2.96, 1.07, 0.74, 0.5, 0.33 y 0.16 h a 30, 40, 50, 60, 70 y 80°C, respectivamente. En contraste, los valores de t1/2 presentados por el extracto producido por la cepa 36 aIV fueron de 1.78, 1.0, 0.8, 0.33, 0.28 y 0.20 h a las mismas condiciones de temperatura. Debido a que la cepa 36 aIV mostró mayor estabilidad, ésta se seleccionó para continuar la presente investigación. Sin embargo, ambas cepas se identificaron molecularmente como: Yarrowia lipolytica (99%) y Aspergillus fumigatus (90%) para las cepas 2.2 aB y 36 aIV, respectivamente. Se purificaron dos proteasas producidas por Aspergillus fumigatus, las cuales fueron denominadas como A y B. Las proteasas A y B fueron purificadas a homogeneidad obteniéndose un porcentaje de recuperación de 6.6 y 3.9% con factor de purificación de 8.8 y 7.1, respectivamente. El peso molecular (SDS-PAGE, tinción plata) de las enzimas monoméricas puras fue de 88 y 45 kDa para la proteasa A y B, respectivamente. La proteasa B presenta N-glicosilación y el 29% del peso molecular es representado por los carbohidratos; en contraste proteasa A no presentó N-glicosilación. La caracterización de las enzimas puras indica que la proteasa A es activa en un rango de pH de 6 a 9, en un rango de temperatura de 50 a 64ºC mostrando la máxima actividad a pH 7 y 60ºC. En tanto que, la proteasa B exhibió actividad en un rango de pH de 8 a 12, en un rango de temperatura de 50 a 66ºC presentando la máxima actividad a pH 10 y 63ºC. Los estudios de estabilidad térmica indican que la proteasa A conserva el 58 y 43% de actividad residual a 50 y 60ºC, mientras que la proteasa B mantiene el 49 y 17% a las mismas condiciones de temperatura en una hora de ensayo. Los t1/2 indican que a 60 y 70ºC la proteasa A presenta mayor estabilidad que la proteasa B. En contraste a 50ºC la proteasa B presenta t1/2 12% mayores, sugiriendo que la proteasas A posee mayor termoestabilidad que la B a temperaturas mayores a 50ºC. La evaluación de la termoestabilidad de la proteasa B previamente digerida con endo H (deglicosilada) se observó que los valores de t1/2 disminuyen a 50 y 60ºC, mientras que a 70 y 80ºC se inactiva completamente. Dichos resultados sugieren que la glicosilación es una característica que confiere estabilidad térmica a esta proteasa. La cinética de inactivación térmica (ecuación Lumry-Eyrin) muestra valores absolutos de 67 kJ mol-1 y -69 J mol-1 de entalpía (∆H*) y entropía (∆S*) respectivamente para la proteasa A, mientras que para la proteasa B se obtuvieron valores de 130 kJ mol-1 y 124 J mol-1 de ∆H* y ∆S* respectivamente. Estos resultados confirman una mayor estabilidad térmica de la proteasa A con respecto a la B. Por otro lado, los parámetros calculados para las temperatura ensayadas indican que la ∆H* es independiente de la temperatura, indicando que no hay cambios en la capacidad calorífica en ambas enzimas. Asimismo, los valores de ∆S* para ambas enzimas fueron negativos, indicando estabilidad térmica en un rango de temperatura de 50 a 70 °C. Adicionalmente, los estudios de inhibición enzimática sugieren que las proteasas A y B pueden pertenecer a la familia de las serín proteasas. Finalmente se concluye que A. fumigatus produce al menos dos proteasas termoestables en CMS con diferentes características estructurales. La glicosilación es una característica estructural que podría participar en la estabilidad térmica de la proteasa B, no se observó efecto del estado de oligomerización en la termoestabilidad. La inserción de carbohidratos en la cadena proteica de la proteasa A, además de la adición de enlaces covalentes que permitan la rigidez y flexibilidad necesaria para la catálisis, permitiría obtener una enzima con características de estabilidad térmica mejoradas. Es importante mencionar que la proteasa A presentó mayor termoestabilidad que las producidas por otras cepas fúngicas previamente reportadas en la literatura.; The interest on thermostable enzymes has increased due to their numerous advantages and industrial applications. The objective of this work was to identify some of the biochemical factors responsible for the thermostability of fungal proteases produced in Solid State Culture (SSC). First the fungal and yeast strains competent to grow at 45ºC; there were selected 29 from 72 assayed strains. Then, the strains that showed proteases production on skim milk agar plates were selected (2.2 aB, 2.7 aB and 36 aIV) to evaluate their protease production by SSC. The strains 2.2 aB and 36 aIV showed maximum activity at 36 h of culture, while the strain 2.7 aB required 48 h to reach maximal protease production, however the enzyme production was 45% lower than the strains 2.2 aB and 36 aIV, for this reason the 2.7 aB was also discarded. The enzymatic extracts produced by the strains 2.2 aB and 36 aIV showed optimum pH and temperature activity at 9 and 7 respectively, at 50ºC. The extract produced by the strain 2.2 aB showed a half life (t1/2) of 2.96, 1.07, 0.74, 0.5, 0.33 and 0.16 h at 30, 40, 50, 60, 70 and 80°C, respectively. In contrast, t1/2 values presented by the extract produced by the strain 36 aIV were of 1.78, 1.0, 0.8, 0.33, 0.28 and 0.20 h at the same temperature conditions. Because the 36 aIV strain showed major thermostability, it was selected to continue this research. However, both strains were identified as Yarrowia lipolytica (99%) and Aspergillus fumigatus (90%) for strains 2.2 aB and 36 aIV respectively. Two proteases produced by Aspergillus fumigatus were purified, which were referred as A and B. Proteases A and B were purified to homogeneity with a finally yield of 6.6 and 3.9% and purification fold of 8.8 and 7.1 respectively. The molecular weight (SDS-PAGE, silver stain) of pure monomeric enzymes was 88 and 45 kDa for protease A and B respectively. The protease B presents N-glycosylation and 29% of its molecular weight is accounted by carbohydrates, in contrast protease A did not show N-glycosylation. Enzymes characterization indicates that protease A is active in the range of pH from 6 to 9, at the temperature range from 50 to 64ºC with maximal activity at pH 7 and 60ºC. Whereas protease B exhibits activity in the range of pH from 8 to 12, at the temperature range from 50 to 66ºC showed maximal activity at pH 10 and 63ºC. Thermal stability assays indicate that protease A retained 58 and 43% of residual activity at 50 and 60ºC, whereas protease B preserved 49 and 17% at the same temperature conditions in both cases after one hour of assay. The t1/2 indicates that at 60 and 70ºC the protease A exhibits higher thermostability than protease B. In contrast, at 50ºC the protease B show t1/2 12% higher than protease A; suggesting that protease A presents additional thermostability than B at temperatures above 50ºC. The evaluation of the thermostability of the protease B previously digested with endo H (deglicosilated), showed that t1/2 values decreased at 50 and 60ºC, whereas at 70 and 80ºC were completely inhibited. These results suggest that glycosylation is a feature that may confer thermal stability on this protease. The thermal inactivation kinetics (Lumry-Eyring equation) shows the absolute values of 67 kJ mol-1 and -69 J mol-1 for enthalpy (∆H*) and entropy (∆S*) respectively for protease A, whereas for protease B, values were 130 kJ mol-1 and 124 J mol-1 for ∆H* and ∆S* respectively. These results corroborate the higher thermal stability for protease A. Nevertheless, parameters obtained at each temperature assayed indicated that ∆H* is independent of the temperature, showing no-change in heat capacity in both enzymes. Furthermore, the ∆S* values for both enzymes were negative, indicative of thermal stability at the temperature range from 50 to 70ºC. Additionally, enzyme inhibition studies suggest that proteases A and B may be considered in the serine protease family. Finally, it is concluded that A. fumigatus produce at least two thermostable proteases in SSC with different molecular characteristics. Glycosylation is a structural feature that may contribute in thermal stabilization of the protease B, no effect on thermal stabilization was showed by the oligomerization state of the enzyme. The insertion of carbohydrates in the protein chain of protease A and the addition of covalent bonds to give the equilibrium between flexibility and rigidity during catalyses at high temperatures provides enzyme with improved thermal stability. It is important enfatice that protease A exhibits higher thermal stability that fungal proteases previously reported in the literature.