Producción de ácido elágico: estudios enzimáticos Público Deposited

The aim of this research is to produce, purify and characterize the enzyme responsible for the ellagitannins degradation. Ellagitanins are a hydrolysable tannins, its main feature is the group hexahydroxydyphenyl (HHDP), that when is released a spontaneous lactonization occurs, which consists of a realignment of the molecule moving to a more stable structure, known as ellagic acid.i Ellagic acid and ellagitannins play a defense roll in the plant against viruses, bacteria, fungi, insects and ruminants. They have an important biological activity like antioxidant, radical scavenging, astringent flavor, coupling with proteins (amino acids) and carbohydrates. This are positioned in the target of researches about on a number of chronic diseases can be prevented or reducing their effects, such as different types of cancer, cholesterol blood decreased, inhibition of some viruses like human papilloma and immune deficiency syndrome, in addition to conventional applications, on the inhibition of pathogenic microorganisms, fungi and skin parasites. There is a large heritage literary on gallotannins biodregradación and gallic acid production, these include the use of bio-microbial cultures that induce biosynthesis of tanin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) generally referred to tannase. This enzyme is an esterase that hydrolyzes the ester linkages in tannins. In the particular case of ellagitanins, information is scarce and confusing, mainly due to the chemical complexity and diversity of ellagitanins. Ellagitanins degradation studies by biological methods (enzymatic or microbial) are becoming a fascinating and promising topic. Published papers on this topic have focused on the production of ellagic acid, assuming the participation of certain enzymes involved in the process. However, it is known that selective hydrolysis of galoyl groups in tannins complex with tannase enzyme produces ellagitanins. Regarding the degradation ellagitanins pathway, is not well defined the enzyme responsible for hydrolysis of the HHDP group, and research to clarify this is needed. Also another important aspect of this topic is the lactonization HHDP conditions for the ellagic acid molecule. So far these two aspects have not been described, and more research have to be done in order to know this aspects will be relevant. The rest of the pathway of biodegradation has been studied and described. In a first part of this work, the extraction of ellagitanins from different sources using the traditional methodologies was addressed. The hydrolysis was carried out using HCl-methanol. The hydrolysis temperature was at 90 °C. The results obtained in mgg1 on dry weight were as follows, to Punica granatum husk ripened and intermediate ripened (12.80 ± 5.83 and 33.79 ± 7.43), Euphorbia antisyphyllitica (2.18 ± 0.39), Larrea tridentata (2.5 ± 0.72), Fluorensia cernua (1.59 ± 0.96) and Jatropha dioica (0.81 ± 0.43). Pomegranate husk was the plant material with the highest concentration of ellagitanins, which proceeded to physico-chemical analysis profile of tannins. The results showed a polyphenols content of 9.3% from total tannins, of which 3.4% are condensed tannins and 5.4% hydrolysable tannins, of which in turn correspond 0.6% to gallotannins and 5.3% to ellagitanins. After material characterization, the second part of the work was to assess the ability of filamentous fungi to used ellagitanins as a carbon and energy source in controlled micro-system and also growth plate analysis was done. In both experiments the strains of Aspergillus niger GH1 and PSH were used. The results of the growth plate showed that A. niger GH1 and PSH grow at a rate of 0.551 ± 0.1122 mmh1 and 0.634 ± 0.0424 mmh1 , respectively. Both strains presented difficulty to grow on the medium with ellagic acid, 0.087 ± 0.1603 mmh1 and 0.050 ± 0.0080 mmh1 respectively. The selected strain of Aspergillus niger GH1 was selected to further studies because his slight tolerance to the product of hydrolysis ellagitanins. However, some questions still remain about this behavior, which may be due to the low solubility of ellagic acid. Selected Punica granatum plant material and the strain of Aspergillus niger GH1, was carried out to assess the stage production of ellagic acid in solid state culture (SSC) using the Pomegranate husk as carbon source and salts of Czapek Dox culture in Petri dishes of 9 cm, time 96 h, temperature 30 °C. The results showed that the pH is kept between 4-5, the water activity was within the range of tolerance for Aspergillus niger (0.99-0.95), consumed 85% of sugars at 72 h cultivation, the total phenol were reduced by 20% at 24 h, and the production of ellagic acid was 12.39 ± 4.0 mg AE/g support for the 48h. Also, in this part of the work, a different system to carry out the production of the ellagitanase enzyme by A. niger GH1 in SSC using pomegranate husk extract as carbon and energy source, the salts of Czapek Dox medium and solid support was polyurethane foam (PUF), were prepared from 250 mL reactor an added to 3 g of PUF, 7 mL of culture medium, were inoculated and maintained at 30 °C for a period of time of 72 h. The results were similar to the previous experiment in the consumption of substrates, however the accumulation of ellagic acid was 50% lower than using the pomegranate husk like a support. Ellagitanase activity was 44.5 ± 1.5 U/L at 48 h of culture. The extract obtained at 48 hours was filtered using cellulose dialysis membrane of 12 kDa, using citrate buffer of pH 5 to 25 mM temperature 2-4 °C, maintained under refrigeration (4-8 °C) by changing the fluid every 8 hours to obtain a clear membrane extract was subjected to FPLC. Finally, filter through 0.45ųm chromatography using a G-25 column for gel permeation, which was obtained 8 fractions, taking ellagitanase activity in the fraction 2, which was fractionated using QXL on an ion exchange column, where 40 fractions were obtained, the activity ellagitanase obtaining fractions 34 and 39, demonstrate the presence of 2 bands in the fraction of G-25 and 200 kDa in only one in fraction 34 and 39 of QXL, the bands were found in an SDS-PAGE gel. Finally, once the purification protocol was developed, experiments were carried out to scale up the production of the enzyme tannase using a tray bioreactor. The enzyme extract obtained was 1950 mL and this was dialysed on cellulose membranes at 12 kDa with citrate buffer solution (25 mM), before filtered by 0.45 membranes, The extract obtained was ultrafiltered and the retained fraction collected, which was separated by a gel permeation column G-25 and finally by QXL a ion exchange column, where the fractions showed a band in SDS-PAGE gel to 200 kDa. The enzyme partially purified was characterized as to concentration substrate effect, pH and reaction temperature. Results showed that ellagitannis concentration of 1 mg mL1 , pH 5 and 60 °C gives the best ellagitanase reaction conditions. This research showed the potential of the Chihuahuan Desert species as ellagitannins sources. Also the development of a bioprocess for the production of ellagitanase enzyme using microorganism isolated from Chihuahua desert was presented.

La presente investigación es un esfuerzo para producir, purificar y caracterizar la enzima responsable de la degradación de elagitaninos, la selección de microorganismos capaces de degradar elagitaninos y la búsqueda de fuentes potenciales de elagitaninos y ácido elágico, Los elagitaninos son una subdivisión de los taninos hidrolizables, su característica principal es el grupo hexahidroxidifénico (HHDP), que al ser liberado, sufre una lactonización espontánea, que consiste de un reacomodo de la molécula pasando a una estructura más estable, conocida como ácido elágico. De manera natural el ácido elágico y los elagitaninos tiene la función de defensa en la planta al igual que otros taninos, contra ataques de virus, bacterias, hongos, insectos y rumiantes. Sin embargo, debido a la actividad biológica que presentan los han puesto en el centro de investigaciones con respecto aun gran número de enfermedades crónicas que pueden ser prevenidas o diminuir sus efectos, tales como, diferentes tipos de cáncer, disminución del colesterol en sangre, facilitador del trasporte de glucosa, inhibidor de algunos virus como el del papiloma humano y síndrome de inmuno deficiencia, además de las aplicaciones clásicas, sobre la inhibición de microorganismos patógenos, hongos cutáneos y parásitos. Existen un gran acervo de literatura sobre la biodregradación de galotaninos para producir ácido gálico, estos bioprocesos incluyen el uso de cultivos microbianos que inducen la biosinteisis de la tanin acil hidrolasa (EC 3.1.1.20) generalmente referida como tanasa, es una esterasa que hidroliza los enlaces éster presentes en los taninos. En el caso particular de los de los elagitaninos, la información es escasa y confusa, principalmente por la complejidad química y la diversidad de los elagitaninos. El estudio de la degradación de elagitaninos por métodos biológicos (enzimáticos o microbianos) se esta convirtiendo en un tema fascinante y prometedor. Trabajos publicados sobre este tema se han centrado en la producción de ácido elágico, suponiendo la participación ciertas enzimas involucras en el proceso. Sin embargo, se sabe que la hidrólisis selectiva de grupos galoilos de taninos complejos con la enzima tanasa produce elagitaninos. En cuanto a la ruta de degradación de elagitaninos, no está definida la enzima responsable de la hidrólisis del grupo HHDP y hace falta información al respecto, también otro aspecto importante sobre esta ruta son las condiciones de lactonización del grupo HHDP a ácido elágico. Hasta el momento los dos no se han descrito claramente. El resto de la ruta de biodegradación ha sido estudiado y descrito. Se ha reportado (2003) la producción de ácido elágico fermentando pomaza de arándanos en cultivo en medio sólido, atribuyendo la catálisis a la enzima βglucosidasa, más tarde en 2005 presentan una enzima llamada valonea tanino hidrolasa. En una primera etapa se evaluaron de forma tradicional (hidrólisis con HClMetanol a temperaturas altas) diferentes fuentes vegetales, para determinar la concentración de elagitaninos, los resultados obtenidos en mgg-1 en base seca fueron los siguientes, para cáscara de granada en estado de maduración intermedia y estado maduro (33.79 ± 7.43 y 12.80 ± 5.83), Candelilla (2.18 ± 0.39), Gobernadora (2.5±0.72), Hojasén (1.59 ± 0.96) y Sangre de drago (0.81 ± 0.43). La cáscara de granada fue el material vegetal con mayor concentración de elagitaninos, por la que se procedió a la realización de un análisis físico-químico y perfil de taninos. En cuanto al perfil de polifenoles se obtuvo que cuenta con 9.3% de los mismos, de los cuales 3.4% son taninos condensados y 5.4% corresponden a taninos hidrolizables, que a su vez los taninos hidrolizables corresponden a 0.6% de galotaninos y 5.3% a elagitaninos. Caracterizado el material vegetal se evaluó la capacidad de hongos filamentosos para emplear los elagitaninos como fuente de carbono y energía en un sistema de microcosmos y finalmente por crecimiento en placa. En los dos experimentos las cepas de Aspergillus niger GH1 y PSH, crecieron sobre las fuentes con elagitaninos. Los resultados del crecimiento en placa mostraron que A. niger GH1 y PSH crecen a una velocidad de 0.551±0.1122 mmh-1 y 0.634±0.0424 mmh-1 respectivamente. Ambas cepas presentaron dificultad para crecer sobre el medio con ácido elágico, 0.087±0.1603 mmh-1 y 0.050±0.0080 mmh-1 respectivamente. Se eligió la cepa de Aspergillus niger GH1, debido su ligera tolerancia al producto de la hidrólisis de elagitaninos. Sin embargo aun quedan dudas sobre este comportamiento, lo cual puede ser debido a la baja solubilidad del ácido elágico.Seleccionado el material vegetal y la cepa de Aspergillus niger GH1, se procedió a realizar la etapa para evaluar la producción de ácido elágico en cultivo en medio sólido (CMS), empleando la cáscara de granada como soporte y fuente de carbono y las sales del medio Czapek Dox mínimo, en cajas de Petri de 9 cm, por 144 h a temperatura de 30 °C. Los resultados obtenidos en esta etapa muestran que el pH se mantiene entre 4-5, la actividad de agua se mantuvo dentro del rango de tolerancia para Aspergillus niger (0.99-0.95), se consumió el 85 % de los azucares a las 72 h de cultivo, Las fenoles totales se redujeron en un 20% a las 24 h, y se obtuvieron 12.39±4.0 mg de AE/g de soporte a las 48 de cultivo. Dentro de la misma etapa se empleó un sistema diferente para llevar a cabo la producción de la enzima elagitanasa por A. niger GH1 en CMS, usando extracto de cáscara de granada como fuente de carbono y energía, las sales del medio Czapek Dox y como soporte espuma de poliuretano (PUF), se prepararon reactores de 250 mL, con 3 g de PUF, 7 mL del medio de cultivo, se inocularon y se mantuvieron a 30° C en una cinética de 72 h. los resultados obtenidos fueron similares al experimento anterior en cuanto al consumo de los sustratos, La acumulación de ácido elágico fue 50% menor que usando el polvo de cáscara de granada. La actividad elagitanasa fue de 44.5 ± 1.5 U/L a las 48 h de cultivo. El extracto obtenido a las 48 horas se dializó por membranas de celulosa de 12 kDa, usando solución amortiguadora de citratos 25mM, a pH 5 temperatura 2-4 °C, manteniéndose en refrigeración (4-8 °C) cambiando el líquido cada 8 horas hasta obtener un extracto transparente. Finalmente, se filtró por membrana de 0.45 m y se sometió a cromatografía en un equipo FPLC, usando una columna G-25 para permeación en gel, en donde se obtuvieron 8 fracciones, teniendo actividad elagitanasa en la fracción 2, la cual fue fraccionada usando en una columna QXL de intercambio iónico, donde se obtuvieron 40 fracciones, se determino la actividad elagitanasa obteniéndose en las fracciones 34 y 39, se evidenció la presencia de 2 bandas en la fracción de G-25 y una de 200 kDa en la fracción 34 de QXL, se evidenciaron las bandas en un gel SDS-PAGE. Obtenido el protocolo para la purificación se procedió a la producción de extracto enzimático, en un reactor de charolas de mayor capacidad, bajo las condiciones de cultivo antes mencionadas, se obtuvieron 1950 mL de extracto enzimático, el cual se dializó en membranas de celulosa de 12 kDa en solución amortiguadora de citratos 25 mM, el extracto dializado se filtro por membranas de 0.45 , El filtrado se ultrafiltro reteniendo el permeado, el cual fue separado por una columna de permeación en gel y finalmente por una columna de intercambio iónico QXL, se evidenciaron las bandas en un gel SDS-PAGE. La enzima purificada fue parcialmente caracterizada en cuanto al efecto de la concentración de sustrato, pH y temperatura de reacción. Los resultados mostraron que a una concentración de 1 mgmL1 de elagitaninos, pH 5 y temperatura de 60 °C se obtienen las mejores condiciones de reacción de la enzima elagitanasa. La presente investigación revela el potencial de especies del Desierto Chihuahuense como fuentes de elagitaninos, la capacidad de hongos filamentos de producir la enzima elagitanasa, además se desarrollo un proceso biotecnológico para la producción de ácido elágico y de la enzima elagitanasa y el papel que desempeña esta en la biodegradación de elagitaninos y la producción de ácido elágico.

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