Producción de lipasas por Yarrowia lipolytica en fermentación en medio sólido Público Deposited
Se evaluó la producción de lipasa por Yarrowia lipolytica en fermentación en medio sólido (FMS) empleando agrolita como soporte inerte. Primero, se obtuvo la curva de crecimiento de Yarrowia lipolytica ATCC 9773 en medio PDA para la producción de inóculo para la FMS. El crecimiento de Yarrowia lipolytica ATCC 9773 en medio PDA mostró un comportamiento de cultivo sincrónico, con dos etapas de crecimiento lineal. Se seleccionó el inóculo de cinco días de incubación, ya que este se encontraba en la segunda fase de crecimiento lineal que tenía mayor concentración celular (3.6x108 células/mL). Posteriormente, se evaluó la producción de lipasa por tres cepas de Yarrowia lipolytica (Yarrowia lipolytica ATCC 9773, Yarrowia lipolytica L0018 y Yarrowia lipolytica PC) mediante cinéticas a 30°C y 40°C. El sistema de fermentación empleado para la FMS consistió en matraces Erlenmeyer de 125 mL con agrolita impregnada con medio de cultivo basal inoculado y aceite de girasol como inductor. La cepa Yarrowia lipolytica ATCC 9773 a las 24 horas mostró la mayor producción de actividad lipasa (2.26 U/gsi) seguida de la cepa Yarrowia lipolytica L0018 (1 U/gsi) a las 48 horas de fermentación, ambas a 30°C, razón por la cual se seleccionaron estas dos cepas para llevar a cabo los siguientes estudios. Con las cepas Yarrowia lipolytica ATCC 9773 y Yarrowia lipolytica L0018 se llevaron a cabo estudios de extracción de lipasa de la materia seca fermentada con soluciones de detergentes (NLS y Tritón X-100 en amortiguador de NaH2PO4 100mM, NaCl 100 mM pH 7.0). Los valores mayores de actividad lipasa se obtuvieron extrayendo con la solución de NLS 3 mM. Además se realizó una cinética de producción de lipasa extrayendo con la solución de NLS 3 mM. La cepa Yarrowia lipolytica ATCC 9773 mostró producción constante de lipasa durante 1 día aproximadamente a partir de las 24 horas de fermentación razón por la cual se seleccionó para realizar los estudios de optimización de la producción de lipasa en FMS. Para los estudios de optimización de la producción de lipasa primero se evaluaron 12 factores mediante un diseño factorial fraccionado 212-8 en la etapa de cribado. A partir de ese diseño se seleccionaron seis factores que se evaluaron en un diseño factorial fraccionado 26-2 en la etapa de búsqueda de primer orden. Se seleccionaron los factores concentración de glucosa, aceite de girasol y urea para evaluarlos en un diseño Box-Behnken, el primer diseño de búsqueda de segundo orden. A partir de este, se seleccionaron los factores concentración de glucosa y urea que se evaluaron en los siguientes diseños (factorial 42 , factorial 32A y factorial 3 2B). Se incluyeron controles en los últimos tres diseños para verificar que la actividad lipasa obtenida en los diseños sobrepasaba la actividad obtenida con las condiciones iniciales de producción de lipasa. Lo cual no ocurrió, razón por la cual se seleccionaron las condiciones y el medio del control como las mejores para la producción de lipasa por Yarrowia lipolytica ATCC 9773 en FMS obteniendo 37.2 U/gsi. Esta actividad sobrepasa los niveles de actividad lipasa de algunos de los reportes de la producción de lipasa por Yarrowia lipolytica en FMS y en fermentación sumergida. Este es el primer reporte de la producción y extracción (con soluciones de detergentes) de lipasas por Yarrowia lipolytica en FMS utilizando agrolita como soporte inerte.
Lipase production by Yarrowia lipolytica in solid state fermentation (SSF) using perlite as inert support was evaluated. Firstly, the growth curve of Yarrowia lipolytica ATCC 9773 in PDA medium for the inoculum production for the SSF was obtained. The growth of Yarrowia lipolytica ATCC 9773 in PDA medium showed a behavior of a synchronic culture, with two lineal growth stages. The inoculum of five days of incubation was selected, because it was in the second stage of lineal growth that had the highest cell concentration (3.6x108 cells/mL). Then the production of lipase by three strains of Yarrowia lipolytica (Yarrowia lipolytica ATCC 9773, Yarrowia lipolytica L0018 y Yarrowia lipolytica PC) was evaluated with kinetics at 30°C and 40°C. The fermentation system employed for the SSF war a 125mL Erlenmeyer flask with perlite impregnated with inoculated basal medium with sunflower oil as inductor. The strain Yarrowia lipolytica ATCC 9773 at 24 hours showed the highest production of lipase activity (2.26 U/gsi) then continued the strain Yarrowia lipolytica L0018 (1 U/gsi) at 48 hours of fermentation, both at 30°C, the reason why these two strains were selected to conduct the following studies. Studies on the extraction of lipase from the dry fermented matter with detergents solutions (NLS y Triton X-100 in NaH2PO4 100mM, NaCl 100 mM pH 7.0 buffer) with the strains Yarrowia lipolytica ATCC 9773 y Yarrowia lipolytica L0018 were carried out. The highest values of lipase activity were obtained extracting with the NLS 3 mM solution. A kinetic of the production of lipase extracting with NLS 3 mM was realized. The strain Yarrowia lipolytica ATCC 9773 showed a constant production during 1 day approximately beginning at 24 hours of fermentation, which is the reason why it was selected to carry out the studies of optimization of the lipase production in SSF. For the optimization of the production of lipase studies, first 12 factors were evaluated using a fractional factorial 2 12-8 design in the stage of screening. From that design six factors were selected and were evaluated in a fractional factorial 2 6-2 at the stage of first order search. The factors glucose, sunflower oil and urea concentration were selected to be evaluated in a Box-Behnken design, the first design of second order search. From this we selected the factors glucose and urea concentrations that were evaluated in the following designs (factorial 42 , factorial 32A y factorial 32B). Controls were included in the last three designs to verify that the lipase activity obtained in the designs exceeded the activity obtained with the initial conditions for lipase production. This did not happen, the reason why the conditions and the medium of the control were chosen as the best for the production of lipase by Yarrowia lipolytica ATCC 9773 in SSF, obtaining 37.2 U/gsi. This activity surpasses lipase activity levels of some of the reports of the production of lipase by Yarrowia lipolytica in SSF and submerged fermentation. This is the first report of the production and extraction (with detergent solutions) of lipase by Yarrowia lipolytica in SSF using perlite as inert support.
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