Producción de compuestos hipoglucemiantes en cultivos de células en suspensión de Cecropia obtusifolia (Bertol) "guarumbo" Público Deposited

Cecropia obtusifolia, popularmente conocida como “guarumbo”, es un árbol medicinal que se utiliza en México para el control de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). La investigación de esta especie, tanto a nivel experimental en animales de laboratorio como en el humano, ha demostrado las propiedades antidiabéticas que posee el vegetal, las cuales son atribuidas a los compuestos fenólicos ácido clorogénico (AC) e isoorientina (ISO). El presente estudio tuvo como objetivo establecer las condiciones in vitro para la propagación masiva de las plantas de C. obtusifolia y para el desarrollo de los cultivos de células en suspensión que conserven la capacidad de producción de los compuestos bioactivos de la planta AC e ISO. Para lo anterior, a partir de explantes de hoja de plantas aclimatadas se establecieron cultivos de callos en medio Murashige y Skoog (MS) empleando diferentes niveles de auxinas; la mejor respuesta se obtuvo utilizando 8.92 μM de ácido naftalenacético (ANA) y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) en combinación con 2.22 μM de bencilaminopurina (BAP). En una etapa posterior, los explantes de hoja, tallo, hipocótilo y cotiledón derivados de plántulas in vitro, desarrollaron callos rizogénicos con 2,4-D; en tanto que los explantes de hoja, hipocótilo y cotiledón formaron callos rizogénicos en el medio de cultivo con ANA y los de tallo formaron callos con brotes. Los brotes se enraizaron en medio MS al 50% libre de hormonas y las plantas formadas se aclimatizaron exitosamente en las condiciones de invernadero; no se observaron variaciones morfológicas entre la población durante su desarrollo y las tasas de crecimiento fueron superiores a las reportadas para las plantas silvestres. En los callos se comprobó por HPLC la presencia de AC en concentraciones similares a las detectadas en las hojas de los árboles en campo, así como su precursor ácido caféico. El otro compuesto fenólico (ISO) no fue producido. Por otra parte, los cultivos de células en suspensión se establecieron a partir de callos friables derivados de explantes de hoja con el tratamiento hormonal de 2,4-D manejando inóculos de 4 y 5 % en peso fresco. Las suspensiones celulares se desarrollaron mejor con el inóculo del 5% y en estos cultivos se determinaron niveles de AC similares a los detectados en las hojas de los árboles silvestres. La ISO se detectó únicamente al final del crecimiento logarítmico. Al disminuir el contenido de los nitratos en el medio MS a 8.0 mM, las biomasas celulares máximas disminuyeron y la concentración de AC detectada se cuadruplicó con respecto a la del cultivo en suspensión con 27.4 mM de nitratos. Con respecto a la producción de ISO, la síntesis de este compuesto se indujo más temprano y por más tiempo, incrementándose sus niveles al final del cultivo. Las hojas del árbol silvestre, plantas aclimatada y obtenida por micropropagación con 6 meses en aclimatización, acumularon ambos compuestos en concentraciones similares entre ellas; sin embargo, las plantas derivadas por micropropagación presentaron diferencias significativas en la acumulación del AC a lo largo de su desarrollo. La aglícona de ISO, luteolina, también fue detectada. Tomando en consideración que las plantas micropropagadas conservaron los componentes y las propiedades hipoglucemiantes de la planta silvestre, se concluye que la propagación in vitro representa una alternativa y perspectiva viable para la propagación masiva y uniforme de los árboles de C. obtusifolia. Otra contribución importante, es el manejo del cultivo de células en suspensión de C. obtusifolia con restricción de nitratos como fuente de material vegetal para la obtención de extractos activos enriquecidos en AC e ISO.

The Cecropia obtusifolia tree, popularly known as guarumbo in Mexico, is used in folk medicine for treatment of type 2 diabetes mellitus (DM2). C. obtusifolia’s antidiabtic effect was assessed in animal models, as well as in humans and attributed to chlorogenic acid (CA) and isoorientine (ISO). The aim of this study was to establish in vitro conditions for the micropropagation and development of cell suspension cultures that conserve the capacity to produce the CA and ISO bioactive compounds that exist in the wild plant. For that, callus cultures of leaf explants from aclimated plant were set up using Murashige and Skoog medium (MS) with different auxins levels; treatments with naphtalene acetic acid (NAA) and 2,4-dichorophenoxi acetic acid (2,4-D) to 8.92 μM with benzylaminopurine (BAP) to 2.22 µM stimulate highest callus production. Cotyledon, hypocotyl, leaf, and stem explants developed calluses bearing roots in a medium enriched with 2,4-D; when hypocotyl, cotyledon and leaf explants were grown on medium with NAA, they developed morphogenic calluses with the presence of abundant roots, while 75% of stem explants formed simple calluses and the remaining explants developed calluses with shoots. Shoots were rooted on free growth regulator MS medium, and whole regenerated plants were aclimatizated under greenhouse conditions; morphological changes were not observed among the population during their development, and growth rates were superior to those reported for wild plants. Recorded concentrations of CA in the different cell lines were similar to those detected in the leaves of wild plants; its precursor caffeic acid was also detected. The other phenolic compound (ISO) was not produced. On the other hand, cell cultures in suspension were established from friable calluses derived from leaf explants with 2,4-D hormonal treatment and employing 4 and 5 % inocula in fresh weight. Better development of cell suspensions was achieved with the 5% inoculum, and the determined CA levels in these cultures were similar to those detected in leaves of wild plants. ISO was detected only at the end of logarithmic growth. On diminishing nitrate content in the MS medium to 8.0 mM, maximum cell biomasses diminished and the CA concentration detected quadrupled with respect to that of the culture in suspension with 27.4 mM of nitrates. Regarding ISO production, synthesis of this compound was induced earlier and for a longer time period, increasing its levels at the end of culture. Leaves from wild tree, aclimated and micropropagated plants with 6 month of acclimatization produced both compounds at similar concentrations; however, micropropagation-derived plants presented significant differences in CA accumulation throughout their development. The aglycone of ISO, luteoline, was also detected. Considering that micropropagated plants retained their ability to produce bioactive compounds and hypoglycemic activity of the wild plant, we concluded that in vitro cultures represent an alternative and interesting perspective for C. obtusifolia tree multiplication. Another important contribution is the handling of cells suspension culture from C. obtusifolia with nitrate restriction like source of vegetal material for the obtaining of enriched active extracts in CA and ISO.

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