Construcción de una proteína híbrida con una hemoglobina y un citocromo P450 bacterianos para mejorar la producción del antibiótico rifamicina Público Deposited
En este trabajo propone resolver la limitación de oxígeno en la biosíntesis de rifamicina B en A. mediterranei, mediante una estrategia donde se redirecciona la utilización del oxígeno; mediante la fusión de las enzimas citocromo P450 (CYP450); monooxigenasa que es responsable de catalizar el paso limitante en la biosíntesis de rifamicina, con la hemoglobina (VHb) de Vitreoscilla stercoraria. Se realizaron diferentes modelamientos para predecir la probable conformación que adoptará la nueva proteína (VHB-CYP); resultante de la unión del CYP450 con la VHb. Además de evaluar la posibilidad de introducir aminoácidos que funcionaran como una bisagra y permitieran un mayor acoplamiento de ambas proteínas. Una vez descartada la utilización de aminoácidos como bisagra y obtener un modelo con una alta probabilidad de existencia en la naturaleza. Se procedió a diseñar y construir un vector de expresión en Amycolatopsis mediterranei para la proteína de fusión Vgh/CYP. Para esta construcción se empleó el plásmido pULVK2, el cual contiene un sitio de replicación para E. coli y A. mediterranei, un gen de resistencia a kanamicina como marcador de selección y un sitio múltiple de clonación que fue aprovechado para la inserción y fusión de los genes orf 5 y vhb. Logrando construir el primer plásmido pUAMLQ1 con las características antes mencionadas. Debido a que A. mediterranei tiende a formar mutantes espontáneas resistentes a kanamicina, fue necesaria la incorporación de un segundo marcador de selección; que fue el gen de resistencia a eritromicina. Este gen fue obtenido del plásmido plJ4026; realizando una doble digestión con las enzimas EcoRI y Xbal e insertado en el plásmido pUAMLQ1 . Obteniendo nuestra segunda construcción, la cual fue utilizada para transformar a A. mediterranei, empleando la técnica de biobalística. Para la selección de las colonias transformadas se empleo un medio de selección con 1 O µg/ml de medio; aquellas colonias que crecieron fueron sometidas a una segunda selección cualitativa. La selección cualitativa de las transformantes que presentaban mayor crecimiento y que tenían una coloración naranja intensa; se interpretó como un probable incremento en la producción de rifamicina B; o bien, por efecto de un mayor contenido de proteínas con grupos hemo, hay que recordar que tanto la hemoglobina como el citocromo P450, podrían generar cierto tono rojizo a las colonias transformantes. De esta forma, se eligió la cepa 1 O; por cumplir con los criterios antes mencionados, y se procedió a realizar las pruebas de fermentación apreciándose una producción de rifamicina a partir de las 24 h de iniciada la fermentación en la cepa transformada con el plásmido pUAMLQ-2, a diferencia de la cepa parental. Incrementándose su producción en condiciones limitantes de aireación, después de 4 días del proceso; en siete veces comparándola con la cepa parental.
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2026-06-22 | Público |
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