Efecto de la sobreexpresión y silenciamiento génico de la triosa fosfato isomerasa de Giardia lamblia como blanco farmacológico para el diseño de antiparasitarios - Rojas Alarcón, Miriam Abigail (Universidad Autónoma Metropolitana, 2022)
La giardiasis es una enfermedad endoparasitaria causada por el protozoario Giardia lamblia. El sistema nacional de vigilancia epidemiológica (SINAVE) consideró la giardiasis en 2020 entre las 10 principales enfermedades parasitarias, acumulando 5 794 casos nuevos. El tratamiento para esta enfermedad no es específico y el parásito genera resistencia a fármacos, por lo que hoy en día se continúa con la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas. La triosafosfato isomerasa (TPI) es una enzima que participa en la vía de la glucólisis; estudios anteriores han demostrado que algunos fármacos derivatizan las cisteínas presentes en la proteína recombinante TPI de G. lamblia, provocando una alteración en su estabilidad térmica y actividad catalítica. Para poder evaluar la importancia de esta proteína para G. lamblia, y encontrar nuevas estrategias farmacológicas, el objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de la sobreexpresión y el silenciamiento por RNA de interferencia del gen triosafosfato isomerasa en el parásito G. lamblia (GlTpi). Para la sobreexpresión se construyó el vector pTub-HisTEV-Tpi, para el silenciamiento se utilizó el vector pTubGdh_eGFP-RNAi, que da origen a síntesis de dsRNA, con tres regiones diferentes del gen GlTpi. Se cultivaron trofozoítos de G. lamblia WB clona C6 en medio TYI-S-33. Para el análisis del efecto de la sobreexpresión se construyó el vector pTub-HisTEV-Tpi, los trofozoítos se transfectaron por electroporación y se seleccionaron con puromicina como antibiótico de selección. La cepa de los trofozoítos que albergaron el plásmido se denominó T1048, los cuales mostraron un aumento de tres veces en la expresión del RNAm de GlTp, respecto a la cepa silvestre (WtWB). La proteína sobreexpresada se evaluó mediante ensayos de inmunofluorescencia, detectando la mayor parte de la proteína en la periferia de la cepa T1048. Además, la sobreexpresión de GlTpi también provocó cambios en el metabolismo, ya que en la cepa T1048 se redujo la concentración de piruvato (1.4 veces), con un aumento de la tasa de producción de etanol (3.5 veces) y un aumento en el consumo de glucosa (3.5 veces) respecto a la cepa WtWB. Se analizaron otros metabolitos que también mostraron diferencias entre las cepas, especialmente cuando se midió la fluorescencia intrínseca del triptófano y la piridoxina. Los datos obtenidos mostraron que la sobreexpresión del gen GlTpi altera el metabolismo de G. lamblia, y estas cepas generadas pueden ser utilizadas como referencia para proponer nuevas dianas y evaluar nuevos fármacos. Para el análisis del efecto del silenciamiento se utilizó el vector pTubGdh_eGFP-RNAi. Se realizó una curva de crecimiento de trofozoítos silvestres (WtWB), transfectados con el vector sin el gen (WtWB-iv) y transfectados con el vector con diferentes regiones del gen (iTpi-R1, iTpi-R2 e iTpi-R3). Se cuantificó la expresión génica por RT-qPCR y se midió la actividad enzimática por espectrofotometría, a 24, 48, 72, y 96 h de cultivo. Los resultados mostraron que el silenciamiento con la región 2 del gen GlTpi disminuyó el crecimiento de los trofozoítos hasta un 78% a las 48 h de cultivo; también disminuyó 0.75 veces la expresión relativa del gen GlTpi a las 24 h, respecto a la cepa WtWB, y disminuyó tres veces la actividad enzimática de la proteína. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión y el silenciamiento son buenas herramientas para el análisis de blancos farmacológicos. Además, se demostró que la proteína TPI de G. lamblia es una enzima importante para la viabilidad del parásito.; Giardiasis is an endoparasitic disease caused by the protozoan Giardia lamblia. In 2020 the National Epidemiological Surveillance System (SINAVE) considered giardiasis among the top 10 parasitic diseases, accumulating 5 794 new cases. Treatment for this disease is not specific and the parasite generates drug resistance, therefore, the search for new therapeutic targets is still ongoing. Triosephosphate isomerase (TPI) is an enzyme that participates in the glycolysis pathway; previous studies have shown that some drugs derivatize the cysteines present in this enzyme, causing an alteration in its thermal stability and catalytic activity. To assess the importance of this enzyme for G. lamblia, and to find new pharmacological strategies, the aim of this work was to evaluate the effects of the overexpression and the silencing, by means of interfering RNA of the G. lamblia triosephosphate isomerase gene (GlTpi). The pTub-HisTEV-Tpi vector was used for the overexpression and the pTubGdh_eGFP-RNAi vector was used for silencing. The latter gives rise to dsRNA synthesis with three different regions of the GlTpi gene. Trophozoites of G. lamblia WB clone C6 were cultured in TYI-S-33 medium. For the overexpression assessment, the vector pTub-HisTEV-Tpi was constructed, and the trophozoites were transfected by means of electroporation and selected using puromycin as a selection antibiotic. The strain of trophozoites harboring the plasmid was named as T1048, which showed a 3-folded increase in GlTpi mRNA expression relative to the wild-type strain (WtWB). The overexpressed protein was assessed by immunofluorescence assays, being most of it detected in the periphery of the strain T1048. Furthermore, GlTpi overexpression also caused changes in metabolism, as the T1048 strain reduced pyruvate concentration (x1.4) and increased both the ethanol production rate (x3.5) and the glucose consumption (x3.5) with respect to WtWB. Other metabolites were also analyzed showing differences between strains, especially when intrinsic fluorescence of tryptophan and pyridoxine was measured. The data obtained showed that overexpression of GlTpi alters the metabolism of G. lamblia, and these generated strains can be used as a reference to develop new targets and evaluate new drugs. For the silencing analysis, the pTubGdh_eGFP-RNAi vector was used. A growth curve of wild-type trophozoites (WtWB), transfected with the vector without the gene (WtWB-iv) and transfected with the vector containing different regions of the gene (iTpi-R1, iTpi-R2 and iTpi-R3) was performed. Gene expression was quantified by RT-qPCR and enzyme activity was measured spectrophotometrically at 24, 48, 72, and 96 culture hours. The results obtained indicate that silencing using region 2 of the GlTpi gene decreased the trophozoite growth by 78% at 48 culture hours. Additionally, it decreases the relative expression of the GlTpi gene by a factor of 0.75 at 24 h compared to the WtWB strain and decreases the enzymatic activity of the protein by three times. These results suggest that overexpression and silencing are good and feasible tools for drug targeting analysis. In addition to this, it was also shown that the TPI protein of G. lamblia is an important enzyme for parasite viability.