Efecto de las sobreexpresión del gen lovE sobre la fisiología de Aspergillus terreus, en fermentación sólida y líquida Público Deposited
Microbial secondary metabolites are produced mainly by species of the family actimomycetes in bacteria and by filamentous fungi. A considerable amount of these show pharmacological activity, like antibiotics. Aspergillus terreus is a fungus that belongs to the Division/Phylum Ascomycota (before Class Ascomycetes), which can produce several interesting natural products. Particularly it produces lovastatin, which reduces cholesterol levels in blood, so it has a high commercial and medicinal value. Lovastatin is conventionally produced by liquid submerged fermentation (SmF), although lately solidstate fermentation (SSF) has become an alternative culture system. However, a disadvantage of SSF is the lack of high producing strains developed for and particularly suited for this system. Hence, this thesis aims to develop methods for genetic improvement of strains for SSF. An advance strategy of genetic improvement is to increase the copy number of a regulatory gene (overexpression). The objective of this thesis was to evaluate the strategy of increasing the copy number of gene lovE (specific transcription factor of the lovastatin gens cluster), and determine its effect on lovastatin production in SSF and in SmF. To this end, A. terreus was transformed with gen lovE, under the control of a constitutive promoter (gpdA from A. nidulans). However, since the vector used (pAN52.1) lacks a marker for fungi, it was necessary to use a cotransformation process with vector pULC43. In this way, 36 transformants were obtained and, as a pre-selection stage, their lovastatin production in fermentation in agar plugs (FCA). Only 10 transformants showed increased production in relation to the parental strain, while the control (transformed with empty vectors) showed production slightly lower than the parental. After this, the preselected transformants were characterized further by determining production in solid-state fermentation (SSF) and in submerged fermentation (SmF), at day 7. In SSF only 4 transformants turned out to be overproducers. T11 displayed a 60.48% production increase, reaching a peak production of 23.27 mg/gdc. The second better was T08 with a 37.17% production increase. From the standpoint of efficiency of the genetic improvement method, it is seen that from the 36 original transformants, only 4 were overproducers in SSF, representing an efficiency of 11.11%. Probably the co-transformation used lowered this parameter. However, it is also evident that the pre-selection stage with FCA added efficiency to the general or complete strategy. It was determined that, with little effort, the use of FCA allowed us to discard 26 lower production transformants. In this way, the integration of FCA as part of the method increases its efficiency to 40%. That is, 40% of the pre selected mutants turned out to be overproducers, which is a very high efficiency for a genetic improvement method. In SmF, the situation was similar, with 4 overproducers out of 10 preselected transformants. However, it is important to note that, although T11 was the best in SmF and SSF, the rest showed different performance in SSF and SmF. For instance, T08, that was the second best in SSF, in SmF showed a 16.56% lower production than the parental strain. In SmF, T11 showed a lovastatin production increase of 40.69%, reaching 00.875 mg/mL, and T26 displayed a 26.84% increase (1.111 mg/mL), while T23 a 18.08% increase (1.034 mg/mL). With the information provided by the Sother blot it was concluded that all confirmed transformants with additional copies of gene lovE were lovastatin overproducers in one or the other culture system. From a basic point of view, it was observed that lovE overexpression did not have a clear effect on morphology. However, results showed it does have a negative effect on sporulation. There are no precedents in the literature, and it is unlikely that lovE can interact with promoters of sporulation genes. However, it is possible that it can interact with elements of the cAMP-PKA signaling cascade.
El hipercolesterolemico lovastatina se produce en forma convencional por fermentación líquida por Aspergillus terreus, aunque últimamente se ha utilizado la fermentación sólida (FS), un nuevo sistema que involucra un material inerte como soporte y muestra una productividad sorprendente. Una desventaja de la fermentación sólida, sin embargo, es la falta de cepas especiales, eficientes en este sistema. Por lo anterior, en esta tesis se pretende desarrollar métodos para mejoramiento genético de cepas para FS. Una estrategia avanzada para generar cepas sobreproductoras de metabolitos es el incremento del número de copias y la sobreexpresión de un gen regulador positivo. El objetivo de este trabajo fue evaluar la estrategia de incrementar el número de copias del gen lovE (gen regulador específico de los genes de biosíntesis lovastatina) y comprobar su efecto sobre la producción de lovastatina en FS y en FL. Para ello, se transformó A. terreus con el gen lovE, bajo el control de un promotor constitutivo (gpd de A. nidulans). Sin embargo, como el vector usado, pAN52.1, carece de un marcador para hongos fue necesario utilizar un proceso de cotransformación con el vector pULC43. Se obtuvieron 36 transformantes totales y como un paso de preselección, se evaluó la producción de lovastatina de las transformantes por Fermentación en Cilindro de Agar (FCA), obteniéndose que, solamente 10 incrementaban la producción con respecto a la parental, mientras que el control (transformada solamente con los vectores pULC43 y pAN52.1 pero sin el inserto lovE) mantuvo una producción ligeramente inferior a la de la parental. Así, se caracterizó a las 10 transformantes preseleccionadas en FCA, midiendo su producción en FS y FL al séptimo día. En FS solamente dos transformantes, de las 10 evaluadas, fueron sobreproductoras. La T11 mostró un incremento de producción de lovastatina de 60.48 %, llegando a una producción de 23.27 mg de lovastatina/gms. Y siguió la T08, con incremento de 37.17% (19.89 mg/gms). Desde el punto de vista de la eficiencia del método de mejoramiento genético, se observa que de treinta y seis transformantes aisladas originalmente solamente 2 fueron realmente sobreproductoras en fermentación sólida, dando una eficiencia de obtención relativamente baja (11.11%). Probablemente, el sistema de cotransformación utilizado le quitó eficiencia a este método. Sin embargo, también es evidente que la técnica de preselección con FCA le agregó eficiencia a la estrategia general. Se constató que con poco esfuerzo, el uso de la FCA permitió de entrada desechar 26 transformantes y concentrar el esfuerzo en las 10 transformantes que mostraron mayor producción que la parental. De esta manera, la integración de la FCA como parte del método subiría la eficiencia al 40%. Es decir, 40% de las cepas preseleccionadas resultaron sobreproductoras, lo cual es un porcentaje notablemente alto para un método de mejoramiento genético. En FL, el panorama fue similar, con cuatro transformantes sobreproductoras de las 10 preseleccionadas. No obstante, es importante notar que, aunque la T11 fue la mejor en FS y en FL, las demás mostraron comportamiento diferente en FS y en FL. Por ejemplo, la T08, que fue la segunda mejor en FS, en FL bajó la producción en 16.56%. De esta manera, en FL la T11 tuvo un incremento en la producción de lovastatina de 40.69%, llegando a una producción de 0.875 mg/mL, la T26 mostró un aumento de 26.84% (1.111 mg/mL) y la T23 un incremento de 18.08% (1.034 mg/mL). Con la información del Southern blot disponible, se concluyó que todas las transformantes, confirmadas con copia(s) adicional(les) de lovE, fueron sobreproductoras de lovastatina en uno u otro sistema de cultivo. Desde el punto de vista básico, se observó que la sobreexpresión de lovE no tuvo un efecto claro sobre la morfología. Sin embargo, los resultados mostraron que sí incide negativamente en la conidiación. No hay ningún antecedente similar en la literatura y es poco probable que LovE pueda interaccionar con promotores relacionados con esporulación. Sin embargo es posible que LovE interactúe con elementos de la cascada de señalización cAMP-PKA.
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