Efecto de la administración de dosis subletales de LPS por la vía oral, en la sobrevida y producción de citocinas durante el desarrollo de sepsis polimicrobiana inducida por ligadura y punción de ciego Público Deposited

Cecal ligation and puncture model (CLP) is used to investigate mechanisms of tissue injury in sepsis. In endotoxic shoch model, administration of sublethal doses of lipopolysaccharide (LPS), protects against subsequent lethal doses; however, this effect is unknown in CLP model. This study was aimed to explore the effect of administration of sublethal doses of LPS by oral route (O), on the survival and cytokine milieu in animals with polymicrobian sepsis. In a first phase male mice Balb/c were grouped into a) sham, b) controls, c) treated with 5 sublethal doses of LPS (50 µg/100 µl) twice a week by intraperitonel route (IP) or d) treated by O route; the control group and those treated with LPS O and IP routes were challenged with CLP. We evaluated survival, positive blood cultures, microbiological testing of stool, serum concentrations of TNF, IFN-γ, IL-6 and IL-10, TNF expression in liver and lung, as well as percentage of Kupffer cells in liver and lung edema, and presence of anti-LPS immunoglobulins. In the second phase, Balb / c mice were divided into a) sham, b) controls, treated prophylactically with c) 0.01, d) 0.1, e) 1 of) 10 mg / kg of F (ab) 2 anti-TNF fragments, this protocol was also tested with F (ab) 2 anti-IFN-γ fragments. In these groups we evaluated the survival and production of serum TNF, IL-1, IL-6, IFN-γ and IL-10. After the protective dose for each antibody, was defined, its administration was initiated at different times. The results of the first phase showed that LPS treatment significantly protected via O in comparison with C group (87% vs 50%; p0.05). This protection was associated with reduced IFN-γ vs C (p <0.05) and increased IL-10 4h after surgery. The TNF expression was abolished at 4h in liver, while it initiates at 4h and continues until 48h in lung of group O vs expression observed in C (1.5- 24h). LPS treatment by O route also reduced the percentage of Kupffer cells in liver (27.5 vs. 37.7) and percentage of lung edema (12.51 vs 26.6) vs C (p <0.05). Finally, in the O group showed a predominance of IgM vs C and IP groups (p <0.05). In the second phase of the study, treatment with F (ab) 2 anti-TNF fragments protected in doses of 1 mg/kg vs C (69 vs 29%; p<0.05). This protection was associated with the coexistence of IL-1β and IL-10 during the first 24 hours of study, and high levels of IL-6; 48 after CLP, IL-1β decreased and IL-10 increased. Finally, we found that treatment with 1 mg /kg of anti-TNF protected only when it was began prior (-2h, -30min) or 30min after from the CLP. Administration of F (ab) 2 fragments anti-IFN-γ protected at doses of 0.01 mg/kg (78% survival) vs C (33%) (p <0.05), which was associated with coexistence of Il-1β and IL-10 during the first 24 hours of study, decreased IL-1β and increased IL-10 48h after of CLP, while IL-6 remained elevated throughout the study. Therapeutic effect of anti-IFN-γ was tested when his administration started -2 or 24h after CLP, increased survival at 88 and 94% respectively vs 54% observed in C (p <0.05). We conclude that the treatment with sublethal doses of LPS by oral route significantly protects in the sepsis murine model induced by CLP.

El modelo de ligadura y punción de ciego (CLP) se utiliza para estudiar mecanismos fisiopatológicos de daño en sepsis. En el modelo de choque endotóxico , la administración de dosis subletales de lipopolisacárido (LPS), protege contra dosis letales posteriores; sin embargo, éste efecto se desconoce en el modelo de CLP. En este estudio se exploró el efecto de la administración de dosis subletales de LPS por la vía oral (O), en la sobrevida y producción de citocinas de animales con sepsis polimicrobiana. Durante la primera fase del estudio, ratones Balb/c machos fueron agrupados en a) sham, b) controles, c) tratados con 5 dosis subletales de LPS (50 µg/100 µl) dos veces por semana vía intraperitoneal (IP) o d) tratados vía O. Sólo los grupos control y tratados con LPS vías IP y O fueron retados con la CLP. Se evaluó superviviencia, positividad de hemocultivos, análisis microbiológico de heces, concentraciones séricas de TNF, IFN-γ, IL-6 e IL-10, expresión de TNF en hígado y pulmón, además del porcentaje de células de Kupffer en hígado y de edema en pulmón, y la presencia de inmunoglobulinas anti-LPS. En la segunda fase, ratones Balb/c fueron agrupados en a) sham, b) controles, tratados profilácticamente con c) 0.01, d) 0.1, e) 1 o f) 10 mg/kg de fragmentos F(ab)2 anti-TNF; éste mismo protocolo fue probado con fragmentos F(ab)2 anti-IFNγ. En estos grupos se evaluó la superviviencia y producción sérica de TNF, IL-1, IL-6, IFN-γ e IL-10. Una vez definida la dosis protectora para cada anticuerpo, su administración se inició en diferentes tiempos para definir su papel terapéutico. Los resultados de la primera fase mostraron que solo la CLP ocasionó una infección polimicrobiana, y que el tratamiento con LPS vía O protegió vs el grupo C (87% vs 50%)(p<0.05). La protección se asoció con reducción de IFN-γ vs C (p<0.05) y aumento de IL-10 4h después de la cirugía, reducción del tiempo de expresión de TNF hasta las 4h en hígado y retraso de la expresión a partir de las 4h en pulmón del grupo O vs la expresión observada en C (desde la 1.5-24h). El tratamiento con LPS vía O también redujo el porcentaje de células de Kupffer en hígado (27.5 vs 37.7) y % de edema en pulmón (12.51 vs 26.6) vs C (p<0.05). Finalmente en el grupo O se observó un predominio de IgM vs los grupos C e IP (p<0.05). En la segunda fase del estudio, el tratamiento con fragmentos F(ab)2 anti-TNF protegió en dosis de 1 mg/kg vs C (69% vs 29%; p<0.05). La protección se asoció a la coexistencia de IL-1β e IL-10 durante las primeras 24h de estudio, además de niveles elevados de IL-6 a las 48, disminuyó IL-1β y aumentó IL-10. Finalmente observó que el tratamiento con 1 mg/kg de anti- TNF, protegió solo cuando se inició -2h, -30min o 30min de la CLP. Por su parte, la administración de fragmentos F(ab)2 anti-IFN-γ aumentó la superviviencia en dosis de 0.01 mg/kg (78%) vs 33% documentado en C (p<0.05), lo que se asoció con la coexistencia de Il-1β e IL-10 durante las primeras 24h de estudio, 48h después disminuyó IL-1β y aumentó IL-10, en tanto que la IL-6 se mantuvo elevada durante todo el estudio. El efecto terapéutico del anti-IFN-γ pudo constatarse cuando se administró -2 o 24h después de la CLP, ya que aumentó la supervivencia en 88 y 94% respectivamente vs 54% observada en C (p<0.05). Se concluye que el tratamiento con dosis subletales de LPS vía oral protegió significativamente en el modelo murino de sepsis inducida por CLP. Palabras clave. CLP, sepsis, tolerancia, coexistencia.

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