Incremento en la dosis génica (pcbAB, pcbC y penDE) en Penicillium chrysogenum para elevar la producción de penicilina G en fermentación sólida y líquida - Campos Muñiz, Carolina (Universidad Autónoma Metropolitana, 2009)
En el presente trabajo se evaluó la producción de penicilina por sobreexpresión de genes de la ruta de la biosíntesis de penicilina en cepas de Penicillium chrysogenum de baja (Wisconsin 54-1255) y de alta (P2-32) producción. Se llevó a cabo la siguiente estrategia para elevar la producción: inicialmente, se identificaron los genes responsables de la biosíntesis, en una biblioteca genómica de P. chrysogenum ligada a un cósmido (IztapaCos). El conjunto de los tres genes de biosíntesis de penicilina fueron detectados mediante sondas marcadas que corresponden a los extremos del grupo (genes pcbAB y penDE). Los genes fueron aislados de las colonias de E. coli que resultaron positivas, utilizando el método de lisis alcalina, y posteriormente se transformaron las cepas Wisconsin 54-1255, P2-32 y npe10 (control) con el “cluster” o conjunto de genes. Las cepas transformadas fueron identificadas mediante resistencia a fleomicina, ya que el vector contiene un gen de resistencia para este antibiótico. Para una primera elección de las mejores transformantes se realizaron bioensayos en cilindros de agar, y fueron elegidas para los estudios en fermentación líquida y sólida las que produjeron mayor concentración de penicilina con respecto a la cepa parental. Considerando la producción basal de penicilina de las cepas controles, se obtuvieron los siguientes resultados: en la cepa P2-32 se presentó mayor producción en las transformantes en los dos tipos de fermentación, con un 158.38% en fermentación líquida y 92.92% en sólida, con respecto a la cepa Wisconsin en la que la producción en fermentación sólida fue del 67.3%. Los resultados mostraron que al incrementar el número de copias de los genes se incrementó la producción de penicilina. ; The present study focuses on the evaluation of penicillin production by low (Wisconsin 54-1255) and high (P2-32) yielding Penicillium strains, where genes from this antibiotic’s biosynthetic-cluster were over-expressed. The following strategy to increase the production was developed: The biosynthesis genes were identified in a P. chrysogenum genomic library linked to a cosmid (Iztapacos). The set of these three genes was detected by the use of radioactively-marked probes corresponding to the terminal sequences of the set (pcbAB and penDE). These genes were isolated from the E. coli colonies that resulted positive, using the alkaline lysis method. After the isolation, transformations of the Wisconsin 54-1255, P2-32 and npe10 (control) Penicillium strains with the “cluster” or gene set were achieved. Transformant strains were identified through phleomycin resistant, since the vector contains a gene for this antibiotic resistance. Initial choice of best transformants was conducted by agarcylinders bioassays, those strains showing higher penicillin yields in comparison to the parental strain were selected for further studies in liquid and solid-state fermentations. Considering the basal penicillin production of parental strains, the following results were observed: The strain P2-32 showed an improved production in both types of fermentation, achieving yields 158.38% and 92.92% higher in liquid and solid-state fermentation respectively, in comparison to the Wisconsin´s yields where an improvement of 67.3% in the solid-state fermentation was observed. These results showed that by increasing the number of gene copies penicillin production is also increase