Purificación parcial y caracterización de proteasas del pepino de mar Isostichopus fuscus y algunas aplicaciones - Hernández Sámano, Arisaí del Carmen (Universidad Autónoma Metropolitana, 2015)
Los organismos marinos se han adaptado a diferentes condiciones ambientales a través del tiempo, estas adaptaciones se han traducido en proteasas con propiedades únicas. Los pepinos de mar son invertebrados del fondo marino apreciados en la gastronomía oriental por su alto valor nutricional y compuestos bioactivos. Dichos organismos poseen un importante carácter autolítico, lo que ha motivado el estudio de sus enzimas proteolíticas. No obstante, hasta el momento no existen reportes acerca de las proteasas de Isostichopus fuscus, una de las especies de pepino de mar más abundantes en México. Por lo tanto, el objetivo de la presente tesis fue purificar parcialmente y caracterizar extractos proteolíticos de diferentes órganos de I. fuscus del Golfo de California (México) y estudiar su capacidad para generar hidrolizados de proteínas. Se capturaron 12 especímenes y se observaron sus características morfológicas externas, se analizaron las espículas presentes y se determinaron los parámetros morfométricos. Los pepinos de mar se disectaron en músculo ventral, tracto digestivo y tentáculos para la determinación del contenido de proteína y obtención de extractos proteolíticos crudos para su caracterización enzimática, en la que se determinó: el pH óptimo de actividad proteolítica, la estabilidad al pH, la temperatura óptima de actividad, la estabilidad a la temperatura, el efecto de almacenamiento a 4°C, cinéticas de desnaturalización térmica, el tiempo de vida media, el efecto de inhibidores de proteasas, el efecto de iones metálicos, el peso molecular por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), y la identificación de actividad proteolítica por zimografía (hidrólisis de caseína 2% a pH 6 y 60°C). Además, se purificaron parcialmente los tres extractos proteolíticos crudos obtenidos, se determinó el efecto del pH y la temperatura sobre su actividad proteolítica, y se estimó el peso molecular de las proteasas presentes por SDS-PAGE. La purificación parcial de los tres extractos proteolíticos se realizó mediante cromatografía de intercambio aniónico, en lote y por cromatografía líquida de baja presión (LPLC) (elución con NaCl 0.5 M). ; El músculo ventral a pH 2-6 (67-80% de actividad residual, excepto a pH 3 con 48% de actividad residual); el tracto digestivo a pH 2-4 y 8 (88-95% de actividad residual); y los tentáculos a pH 3-5 y 7 (91-95% de actividad residual). De manera análoga, las temperaturas óptimas de actividad proteolítica de los extractos proteolíticos crudos fueron 40-60°C; 40 y 70 °C; y 60°C, respectivamente. Adicionalmente, se observó que a bajas temperaturas, entre 0 y 10 °C, los tres extractos proteolíticos estudiados presentaron actividad proteolítica, ésta es una característica relevante debido a que permitiría un menor gasto de energía ya que no sería necesario elevar la temperatura para alcanzar alta actividad proteolítica. Los extractos proteolíticos fueron estables a temperaturas entre 10 y 50°C; el músculo ventral de 20-30°C (91-100% de actividad residual); el tracto digestivo de 30- 50°C (85-89% de actividad residual); y los tentáculos a 10 y 30 °C (85-86% de actividad residual); por lo que el tracto digestivo fue el más estable a alta temperatura. Los extractos proteolíticos crudos presentaron actividades residuales de 52% para el músculo ventral, 41% para el tracto digestivo y 66% para los tentáculos, después de permanecer 22 días a 4°C. Además, todos los extractos proteolíticos presentaron hasta 79% de actividad residual al incubarse por 1 h a 70°C con tiempos de vida media alrededor de 3 h; el extracto del músculo ventral fue el más estable a la desnaturalización térmica con tiempo de vida media de 3.5 h, seguido del extracto del tracto digestivo con 3.1 h y de los tentáculos con 2.6 h. No obstante, no es posible establecer la resistencia de una proteasa específica a la desnaturalización por calor, debido a que se emplearon extractos crudos donde están presentes diferentes enzimas proteolíticas. El comportamiento de los extractos proteolíticos crudos de I. fuscus ante el pH y temperatura, indicó que las proteasas de I. fuscus tienen mayor estabilidad a pH y temperatura que lo reportado para el pepino de mar Stichopus japonicus, sugiriendo que las características de las proteasas de I. fuscus están ligadas a las diferencias que existen entre dichas especies y los hábitats en que se desarrollan.; El extracto proteolítico del músculo ventral, adicionalmente, se sometió a precipitación de proteínas con sulfato de amonio saturado al 60% y ultrafiltración con membranas de 100 kDa (recuperando las proteasas mayores a 100 kDa), debido a que con esa combinación de métodos de purificación se obtuvo mayor actividad proteolítica durante estudios preliminares. Posteriormente, los extractos proteolíticos parcialmente purificados fueron purificados por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) registrando su actividad proteolítica, factor de purificación y porcentaje de recuperación, asimismo se determinó la homología de las proteasas purificadas de I. fuscus con otras proteasas por medio de espectrometría de masas (MS). Finalmente, se utilizó el extracto proteolítico parcialmente purificado de los tentáculos para generar hidrolizados de proteína. Los hidrolizados de proteína se obtuvieron a partir del músculo dorsal de I. fuscus, de dos proteínas del huevo (ovoalbúmina y lisozima) y dos proteínas lácteas (caseína y βlactoglobulina). Los hidrolizados de proteína fueron generados con diferentes relaciones enzima:sustrato y tiempos de hidrólisis. En el caso de los hidrolizados del músculo dorsal se midió la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) de los péptidos generados, seleccionando el hidrolizado con mayor valor de ORAC para la purificación del péptido con mayor capacidad antioxidante, la cual consto de ultrafiltración con membranas de 3 kDa y RP-HPLC. En el caso de los hidrolizados de las proteínas de huevo y leche, los péptidos generados se analizaron por SDS-PAGE y RP-HPLC, seleccionando las proteínas con mayor hidrólisis. Las características morfológicas externas y el análisis de espículas confirmaron el género y la especie de I. fuscus, el peso y longitud promedios fueron de 380 g y 23.3 cm correspondientes a especímenes adultos de 5 a 7 años de edad. Se determinó 21% de proteína en el músculo ventral, 32% en el tracto digestivo y 15% en los tentáculos, similar a lo reportado para Isostichopus badionotus. El extracto proteolítico crudo del músculo ventral presentó actividad óptima a pH 2, 6, y 8 (37°C). Los extractos proteolíticos crudos del tracto digestivo y de los tentáculos coincidieron en el pH óptimo de actividad, presentando actividad máxima a pH 6 y 8 (37°C). Los extractos proteolíticos crudos de las tres regiones estudiadas presentaron estabilidad en un intervalo de pH entre 2 y 8.; El pH del agua donde habitan los pepinos de mar podría influir en el comportamiento de sus enzimas digestivas como se ha demostrado para otras especies marinas, el pH para el cultivo óptimo de I. fuscus es de 8.4-8.5. Asimismo, la tendencia del aumento de la actividad proteolítica hacia pH alcalino podría explicarse debido a que los pepinos de mar se alimentan de forma constante y por tanto ingiere grandes cantidades de agua de mar la cual se encuentra a pH neutro, así como al tipo de alimentación, ya que se ha demostrado que factores tales como características fisiológicas y régimen nutricional influyen en la actividad de las enzimas digestivas de especies marinas. Las temperaturas a las que se presentaron las actividades proteolíticas óptimas, a pH 6, de los extractos proteolíticos parcialmente purificados del músculo ventral, del tracto digestivo y de los tentáculos fueron 50°C, 60°C, 10°C, respectivamente; mientras que las actividades proteolíticas óptimas a pH 8 se observaron a 10°C para el músculo ventral; 50°C para el tracto digestivo; y 30 y 50 °C para los tentáculos. En general, las proteasas de I. fuscus mostraron actividad óptima a temperaturas más altas que las proteasas de S. japonicus, posiblemente por las características fisicoquímicas del medio ambiente en que se desarrolla, ya que S. japonicus habita en ambientes con temperaturas de 3°C a 26°C, e I. fuscus puede vivir en aguas de 8°C a más de 30°C. Se ha reportado que la temperatura óptima de las proteasas de organismos marinos generalmente varía con el tipo de órganos y especies. En el mismo contexto, en los pH´s y temperaturas estudiados, el extracto proteolítico parcialmente purificado de los tentáculos mostró mayor actividad proteolítica que los otros extractos estudiados, lo que sugirió un sistema alternativo de digestión ya que el pepino de mar es capaz de expulsar sus órgano internos (como método de defensa) y regenerarlos. Se identificó una proteasa con peso molecular estimado entre 46 y 49 kDa en los tres extractos proteolíticos parcialmente purificados (músculo ventral, 49 kDa; tracto digestivo, 47 kDa; tentáculos, 46 kDa). Los resultados coincidieron con lo reportado para cisteín y metalo proteasas de S. japonicus. Los extractos proteolíticos purificados del músculo ventral, del tracto digestivo y de los tentáculos presentaron actividades específicas de 17252 U/mg, 7504 U/mg, y 3907 U/mg, con factores de purificación de 26.6, 28.2, y 12.2, y recuperación del 0.5%, 1.2%, y 1.7%, respectivamente. Se encontró ligera homología con tripsina y complejo tripsina-inhibidor de triptasa (LDTI, “Leech derived tryptase inhibitor”), sin embargo, al no tener homología con serín, aspartil, cisteín o metalo proteasas previamente descritas, se sugirió que pueden tratarse de nuevos miembros del grupo de las proteasas. El hidrolizado de proteína muscular de I. fuscus generado con el extracto proteolítico parcialmente purificado de los tentáculos de I. fuscus, tuvo mayor actividad antioxidante con una relación enzima:sustrato de 1:1 por 24 h.; A pH 6, el extracto proteolítico crudo del músculo ventral fue parcialmente inhibido con pepstatina A (68% de actividad residual) y β-mercaptoetanol (76% de actividad residual); el extracto proteolítico del tracto digestivo fue parcialmente inhibido con PMSF (79% de actividad residual) y pepstatina A (81% de actividad residual); y el extracto proteolítico de los tentáculos fue parcialmente inhibido con TLCK (79% de actividad residual) y pepstatina A (83% de actividad residual). Por lo tanto, se sugirió la presencia predominante de aspartil y cisteín proteasas en el extracto proteolítico del músculo ventral, y en los extractos proteolíticos del tracto digestivo y de los tentáculos, la presencia de serín y aspartil proteasas. A pH 8, los extractos proteolíticos crudos mostraron inhibición significativa con EDTA (actividades residuales de 41% para músculo ventral, 71% para tracto digestivo y 81% para tentáculos) y TI (actividades residuales de 54% para músculo ventral, 75% para tracto digestivo y 82% para tentáculos). Por lo tanto, los resultados anteriores sugirieron la presencia predominante de metalo proteasas en los tres extractos proteolíticos. La actividad de las proteasas del extracto del músculo ventral se inhibió cerca de la mitad con Cu²⁺ (42% de actividad residual) y Mn2+ (59% de actividad residual), mientras que Hg²⁺ aumentó 16% la actividad proteolítica; el extracto proteolítico del tracto digestivo presentó la menor actividad residual con Ba2+ (75%), mientras que el Ca²⁺ aumentó 1% la actividad proteolítica; y el extracto proteolítico de los tentáculos se inhibió parcialmente con Ba²⁺ (71% de actividad residual). El extracto proteolítico del músculo ventral presentó una proteína predominante de 180 kDa; en el extracto del tracto digestivo se identificaron dos proteínas de 109 y 39-42 kDa; y en el extracto de los tentáculos tres proteínas de 106, 68 y 39 kDa. Los estudios de zimografía mostraron la presencia de proteasas en los tres extractos proteolíticos. Con base en los resultados obtenidos en los estudios de efecto de iones sobre las proteasas y electroforesis, se sugirió la presencia de cisteín y metalo proteasas en los tres extractos proteolíticos crudos. Los tres extractos proteolíticos parcialmente purificados mostraron actividades óptimas en los siguientes valores o intervalos de pH: pH 6-8 y pH 10 para el músculo ventral; pH 6 y pH 8-9 para el tracto digestivo; y pH 6-8 para los tentáculos; similar a lo reportado para S. japonicus.; La fracción con peso molecular menor a 3kDa de dicho hidrolizado tuvo una capacidad antioxidante de 0.92 µmolTrolox/mgproteína (valor de ORAC), coincidiendo con el efecto antioxidante del Trolox (antioxidante sintético). El péptido purificado de dicha fracción tuvo un valor de ORAC de 0.74 µmolTrolox/mgproteína. La producción de péptidos antioxidantes a partir del músculo de I. fuscus autolizado o de baja calidad puede ser una alternativa para aprovechar este recurso. Por otra parte, la ovoalbúmina y la caseína tuvieron mayor hidrólisis con el extracto proteolítico parcialmente purificado de los tentáculos de I. fuscus (relación enzima:sustrato 1:2, v/v) comparado con la hidrólisis de lisozima y β-lactoglobulina. Se obtuvieron péptidos de ovoalbúmina de 30-36 kDa a 60°C por 24 h, y péptidos de 8-30 y 33.8 kDa a 7°C por 48 h; y en la hidrólisis de caseína se obtuvieron péptidos de 10-20 y menor a 10 kDa a 60°C por 24 h, tres péptidos de 10.6, 11.3, y 7.2 kDa a 7°C por 24 h y un péptido de 7.2 kDa a 7°C por 48 h. La caseína se hidrolizó nuevamente pero a una relación enzima:sustrato mayor (1:4, v/v) generándose péptidos de 14.2, 17.6 y 19.5 kDa a 7 y 60 °C por 24 h, y un péptido de 14.2 kDa a 7°C por 48 h. Existen escasos reportes sobre hidrólisis de ovoalbúmina y caseína a baja temperatura. El presente estudio puede ser relevante, una vez estudiada la inmunorespuesta de los hidrolizados obtenidos, debido a que una parte de la población pediátrica es alérgica a las proteínas de leche y/o huevo. Además, los péptidos generados en la hidrólisis de caseína y ovoalbúmina podrían poseer actividades biológicas benéficas. En conclusión, se observó la presencia de proteasas estables al pH, a la temperatura y al almacenamiento en refrigeración, y con actividad proteolítica a baja temperatura, lo que genera ventajas en su utilización. En el mismo contexto, el estudio del extracto proteolítico de los tentáculos de I. fuscus es una aportación novedosa ya que hasta el momento se desconocen reportes sobre proteasas de los tentáculos de pepinos de mar. Adicionalmente, no se ha reportado la presencia de péptidos antioxidantes en hidrolizados de proteína de I. fuscus, ni la generación de hidrolizados de proteínas (en este caso, proteína muscular de I. fuscus, y proteínas de huevo y leche) con proteasas de pepino de mar.