Construcción de CLEAs de lipasas: evaluación del efecto y modulación de la enantioselectividad - Velasco Lozano, Susana (Universidad Autónoma Metropolitana, 2014)
La propuesta del presente proyecto se centró en la construcción de enzimas inmovilizadas en forma de agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs) empleando como agentes de entrecruzamiento polímeros multiaminados. Dicho mecanismo de unión se llevó a cabo mediante la formación de enlaces amida a partir de los grupos carboxilo libres de las enzimas y los grupos amino de los agentes de entrecruzamiento empleados. Para ello, los grupos carboxilo fueron previamente activados con la adición de una mezcla 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) para volverse capaces de reaccionar con grupos amino. Como enzima modelo de estudio se seleccionó a la lipasa de Candida rugosa (CRL). En nuestro conocimiento, es la primera vez que se llevó a cabo el entrecruzamiento propuesto para la preparación de CLEAs. El primer paso consistió en la selección de un agente de precipitación. El acetonitrilo fue elegido ya que presentó la mayor capacidad precipitante de la CRL, y además tuvo el menor efecto desnaturalizante. Posteriormente, se estudiaron las variables más importantes que rigen el entrecruzamiento de proteínas mediante el mecanismo propuesto. Dentro de las cuales se encontraron: 1) La concentración de agua presente en el medio de reacción cuando éste es un solvente orgánico, 2) El pH cuando el medio de entrecruzamiento es acuoso, 3) La concentración de EDC-NHS, 4) La adición de albúmina sérica bovina (BSA) como fuente proteica externa, y 5) La adición de trioctanoína como sustrato de bioimprinting para la conservación y protección del sitio catalítico en su forma activa durante el entrecruzamiento (la adición de trioctanoína 0.28 mM permitió recuperar CLEAs con el doble de actividad específica). Además de los CLEAs de la CRL (CRL-CLEAs), se prepararon CLEAs de las lipasas comerciales de Candida antarctica B (CALB) y Thermomyces lanuginosus (TLL). Todos estos biocatalizadores expresaron alrededor del 20-26% de la actividad inmovilizada en forma de CLEAs. La mayor actividad residual en los CRL-CLEAs fue del 15% de la inicial. La pérdida de actividad de los CLEAs de lipasas entrecruzados vía sus grupos carboxilo (carboxi-CLEAs) se relacionó con el proceso de entrecruzamiento de los grupos carboxilo de la enzima. Una vez establecida la metodología general de preparación de CLEAs, se evaluó el efecto de las condiciones de preparación en las propiedades catalíticas de éstos biocatalizadores. Dentro de las variables estudiadas se encontró que la concentración de EDC/NHS, la adición de BSA y el tamaño de la polietilenimina (PEI) tienen un fuerte impacto en la morfología, actividad específica, termoestabilidad y enantioselectividad de los CLEAs. En esta etapa los CLEAs preparados con EDC/NHS 28 mM, BSA (10 mg) y PEI1.3, fueron seleccionados como los biocatalizadores más robustos ya que fueron más activos, estables y enantioselectivos. Dichos CLEAs fueron 1.3 veces más activos y más termoestables que los CLEAs preparados por el método tradicional de entrecruzamiento con glutaraldehído. Como reacción modelo de estudio para la evaluación de la enantioselectividad se probaron los diferentes CLEAs en la resolución del (S)-ácido mandélico a partir de la mezcla racémica del ácido 2-O-butiril-2-fenilacético. En esta reacción modelo, los CRL-CLEAs alcanzaron un 91% de exceso enantiomérico en la resolución del (S)-ácido mandélico. Como parte complementaria al presente proyecto se prepararon derivados inmovilizados de CRL sobre soportes persistentes de agarosa para su comparación con los derivados de la CRL en forma de CLEAs. Una vez obtenidos todos los derivados de la CRL inmovilizados con y sin soporte se procedió a evaluar su estabilidad. El derivado más termoestable a 50°C fue la CRL inmovilizada sobre glioxil-agarosa (glioxil-CRL) que retuvo el 85% de su actividad inicial por 150 h bajo las condiciones probadas. Por su estabilidad frente al etanol al 40%, los derivados más estables fueron el CLEA entrecruzado con glutaraldehído (amino-CLEA) y el glioxil-CRL (50 y 60% de actividad residual después de 97 h de tratamiento, respectivamente). Mientras que por su estabilidad en ciclohexano el derivado más estable fue la CRL inmovilizada en naftil-agarosa (naftil-CRL) (300% de actividad residual después de 100 h de tratamiento). Posteriormente se aplicaron los biocatalizadores preparados con y sin soporte en la resolución de dos sustratos enantioméricos, (S)-1-feniletanol y (R)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Mediante la mezcla de los diversos protocolos de inmovilización, las modificaciones químicas y físicas de la enzima, así como las diferentes condiciones de reacción probadas, permitieron la obtención de al menos un biocatalizador que presentara una alta enantioselectividad (E > 20) en cada una de las dos resoluciones enantioméricas estudiadas. Como otra parte complementaria a este proyecto se aplicaron los derivados de la CRL preparados en la hidrólisis del aceite de sardina para la liberación selectiva de los ácidos eicosapentaenóico (EPA) y docosahexaenóico (DHA). En esta aplicación los CRL-CLEAs mostraron la mayor y selectividad EPA/DHA.; The present work was focused on the design and production of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) employing amino-containing polymers as cross-linkers. The enzyme was covalently bound by the amide bond formation between carboxyl-activated groups of enzyme and the amino groups of the cross-linkers. The free carboxyl groups of the enzyme were first activated with carbodiimide (EDC)-succinimide (NHS) in organic medium, and then the activated protein was cross-linked with different polyethyleneimines (PEIs). The lipase from Candida rugosa (CRL) was selected as protein model. To our knowledge, this is the first report of CLEAs produced by using amino-containing polymers as cross-linkers. Acetonitrile was chosen as precipitant agent due to its lower denaturing effect on CRL. The most important variables that govern the protein cross-linking based on the proposed mechanism were identified: i) the water concentration in the reaction medium when it is an organic solvent, ii) the pH when the cross-linking process is carried out in an aqueous medium, iii) the EDC-NHS concentration, iv) the addition of bovine serum albumin (BSA), and v) the addition of trioctanoin as bioimprinting substrate for the conservation and protection of the active-site pocket (the addition of 0.28 mM trioctanoína provided 2-fold CLEAs activity). In addition to CLEAs of CRL (CRL-CLEAs), CLEAs of other lipases, Candida antarctica B (CALB) and Thermomyces lanuginosus (TLL), were prepared. All the biocatalysts showed 20- 26% of the activity found with the free enzyme. The highest activity found in the CRL-CLEAs represented 15% of the initial lipase activity. The loss of activity during the cross-linking via their carboxyl groups (carboxy-CLEAs) is related to the process of cross-linking the carboxyl groups of the enzyme. Once the general preparation procedure for CLEAs was established, the effect of the preparation conditions on the catalytic properties of these biocatalysts was evaluated. The effect of the cross-linker chain length, the amount of added BSA, and EDC-NHS concentrations on the catalytic properties of resulting cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) were investigated. The CLEAs’ size, shape, specific activity, activity recovery, thermostability and enantioselectivity significantly varied according to the preparation procedure. The most robust CLEAs were obtained with 1.3 kDa polyethyleneimine as cross-linker, 10 mg of BSA and 28 mM of EDCNHS. This preparation was 1.3-fold more active and more thermostable than CLEAs prepared by the traditional method of amino cross-linking with glutaraldehyde, and retained 60% of residual activity after 22 h at 50°C. Additionally, the CRL-CLEA preparation showed an enantioselectivity of 91% enantiomeric excess (ee) in the resolution of (S)-mandelic acid. As a complement of the present project, immobilized derivatives of CRL on agarose-based supports were prepared; and then were compared against CRL-CLEAs. After the production of all CRL-derivatives with or without support, their stability was evaluated. The most thermostable derivative was the one immobilized on glyoxyl-agarose (glyoxyl-CRL) retaining 85% of residual activity after 150 h under the tested conditions. Due to their stability against ethanol at 40%, the more stable derivatives were the glutaraldehyde-cross-linked CLEA (amino-CLEA) and glyoxylCRL (50 and 60% of residual activity after 97 h of treatment, respectively). Whilst, due to their stability against cyclohexane at 50%, the more stable biocatalyst was the one immobilized on naphthyl-agarose (naphthyl-CRL) (300% of residual activity after 100 h of treatment). Afterwards, the carrier-free and carried-bond biocatalysts were tested in the resolution of two enantiomeric substrates, (S)-1-phenylethanol and (R)-2-hydroxy-4-phenyl ethylbutyrate. By mixing different immobilization protocols, chemical and physical modification of enzymes and varied reaction conditions, the achievement of at least one high enantioselective biocatalyst (E > 20) in the tested resolutions were attained. Finally, the biocatalysts were applied in the production of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) during the sardine oil hydrolysis. In this application, the CRLCLEAs showed the highest EPA/DHA selectivity.