Construcción de CLEAs de lipasas: evaluación del efecto y modulación de la enantioselectividad Público Deposited

La propuesta del presente proyecto se centró en la construcción de enzimas inmovilizadas en forma de agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs) empleando como agentes de entrecruzamiento polímeros multiaminados. Dicho mecanismo de unión se llevó a cabo mediante la formación de enlaces amida a partir de los grupos carboxilo libres de las enzimas y los grupos amino de los agentes de entrecruzamiento empleados. Para ello, los grupos carboxilo fueron previamente activados con la adición de una mezcla 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) para volverse capaces de reaccionar con grupos amino. Como enzima modelo de estudio se seleccionó a la lipasa de Candida rugosa (CRL). En nuestro conocimiento, es la primera vez que se llevó a cabo el entrecruzamiento propuesto para la preparación de CLEAs. El primer paso consistió en la selección de un agente de precipitación. El acetonitrilo fue elegido ya que presentó la mayor capacidad precipitante de la CRL, y además tuvo el menor efecto desnaturalizante. Posteriormente, se estudiaron las variables más importantes que rigen el entrecruzamiento de proteínas mediante el mecanismo propuesto. Dentro de las cuales se encontraron: 1) La concentración de agua presente en el medio de reacción cuando éste es un solvente orgánico, 2) El pH cuando el medio de entrecruzamiento es acuoso, 3) La concentración de EDC-NHS, 4) La adición de albúmina sérica bovina (BSA) como fuente proteica externa, y 5) La adición de trioctanoína como sustrato de bioimprinting para la conservación y protección del sitio catalítico en su forma activa durante el entrecruzamiento (la adición de trioctanoína 0.28 mM permitió recuperar CLEAs con el doble de actividad específica). Además de los CLEAs de la CRL (CRL-CLEAs), se prepararon CLEAs de las lipasas comerciales de Candida antarctica B (CALB) y Thermomyces lanuginosus (TLL). Todos estos biocatalizadores expresaron alrededor del 20-26% de la actividad inmovilizada en forma de CLEAs. La mayor actividad residual en los CRL-CLEAs fue del 15% de la inicial. La pérdida de actividad de los CLEAs de lipasas entrecruzados vía sus grupos carboxilo (carboxi-CLEAs) se relacionó con el proceso de entrecruzamiento de los grupos carboxilo de la enzima. Una vez establecida la metodología general de preparación de CLEAs, se evaluó el efecto de las condiciones de preparación en las propiedades catalíticas de éstos biocatalizadores.

Dentro de las variables estudiadas se encontró que la concentración de EDC/NHS, la adición de BSA y el tamaño de la polietilenimina (PEI) tienen un fuerte impacto en la morfología, actividad específica, termoestabilidad y enantioselectividad de los CLEAs. En esta etapa los CLEAs preparados con EDC/NHS 28 mM, BSA (10 mg) y PEI1.3, fueron seleccionados como los biocatalizadores más robustos ya que fueron más activos, estables y enantioselectivos. Dichos CLEAs fueron 1.3 veces más activos y más termoestables que los CLEAs preparados por el método tradicional de entrecruzamiento con glutaraldehído. Como reacción modelo de estudio para la evaluación de la enantioselectividad se probaron los diferentes CLEAs en la resolución del (S)-ácido mandélico a partir de la mezcla racémica del ácido 2-O-butiril-2-fenilacético. En esta reacción modelo, los CRL-CLEAs alcanzaron un 91% de exceso enantiomérico en la resolución del (S)-ácido mandélico. Como parte complementaria al presente proyecto se prepararon derivados inmovilizados de CRL sobre soportes persistentes de agarosa para su comparación con los derivados de la CRL en forma de CLEAs. Una vez obtenidos todos los derivados de la CRL inmovilizados con y sin soporte se procedió a evaluar su estabilidad. El derivado más termoestable a 50°C fue la CRL inmovilizada sobre glioxil-agarosa (glioxil-CRL) que retuvo el 85% de su actividad inicial por 150 h bajo las condiciones probadas. Por su estabilidad frente al etanol al 40%, los derivados más estables fueron el CLEA entrecruzado con glutaraldehído (amino-CLEA) y el glioxil-CRL (50 y 60% de actividad residual después de 97 h de tratamiento, respectivamente). Mientras que por su estabilidad en ciclohexano el derivado más estable fue la CRL inmovilizada en naftil-agarosa (naftil-CRL) (300% de actividad residual después de 100 h de tratamiento). Posteriormente se aplicaron los biocatalizadores preparados con y sin soporte en la resolución de dos sustratos enantioméricos, (S)-1-feniletanol y (R)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Mediante la mezcla de los diversos protocolos de inmovilización, las modificaciones químicas y físicas de la enzima, así como las diferentes condiciones de reacción probadas, permitieron la obtención de al menos un biocatalizador que presentara una alta enantioselectividad (E > 20) en cada una de las dos resoluciones enantioméricas estudiadas. Como otra parte complementaria a este proyecto se aplicaron los derivados de la CRL preparados en la hidrólisis del aceite de sardina para la liberación selectiva de los ácidos eicosapentaenóico (EPA) y docosahexaenóico (DHA). En esta aplicación los CRL-CLEAs mostraron la mayor y selectividad EPA/DHA.

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  • 2014
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Última modificación: 09/22/2022
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