Desarrollo y viabilidad de embriones bovinos producidos in vitro después de ser vitrificados con etilén glicol y trehalosa en la pajilla con borde biselado (bes) Público Deposited
This study was designed to evaluate the efficiency of bovine embryo vitrification in the morula stage, using Ethylene Glycol (EG) and trehalose in the beveled straw (beveled edge straw; BES) and its effects in viability and development potential after devitrification. For embryo production in vitro (IVP) ovaries were collected at a slaughterhouse and were transported to the laboratory in 0.9% saline solution, follicles 2 to 8 mm in diameter were punctured to collect cumulus-oocyte complexes (COCs), obtaining a total of 678 COCs, which were subjected to in vitro maturation (IVM) in TCM-199 medium for 24 h, randomly using 84 oocytes to evaluate IVM by Hoechst staining. In vitro fertilization (IVF) was performed in mTBM medium, using frozen semen during 18 h of co-incubation; at the end of this period 78 oocytes were randomly used to evaluate IVF. The remaining 516 presumptive zygotes were divided in two groups: Group 1: embryos not exposed to vitrification and developed to the morula stage on day 5 post-insemination, which were developed to blastocyst (control group). Group 2: a total of 421 presumptive zygotes which were divided in groups 2A: presumptive zygotes for development, those developing to morulae were vitrified for 15 days and then devitrified to evaluate viability. In group 2B, 204 presumptive zygotes were included, the developing morulae were vitrified for the same period as the previous group and cultured for 72 hours, for development to blastocyst (day 8 post-insemination) and for 48 more hours to determine their eclosion rate. The results were as follows: In the group of morulae without vitrification, embryo cleavage was 73.6%, reaching a blastocyst development rate of 32.8% and a blastocyst/morulae ratio of 23/26. The viability of the devitrified morulae was 38.7%, while in the morulae cultured after devitrification, 27.9% reached the blastocyst stage. Finally, the hatching percentage of the morulae developing to blastocysts was 47.3%. Embryo development obtained in the non-vitrified morulae was in agreement with literature reports, demonstrating that the IVP protocol is capable to provide morula and blastocyst stage embryos. The BES showed to be an appropriate device, preserving viability, recovery and embryo development potential, with the advantage of being an economical device of easy access. This study is the first report of IVP morulae, vitrified in BES allowing blastocyst hatching. Key words: In vitro fertilization, morula, bovine, vitrification, ethylene glycol, trehalose, beveled edge straw (BES).
Este estudio fue diseñado para evaluar la eficiencia de la vitrificación de embriones bovinos en estadio de mórula, utilizando etilenglicol (EG) y trehalosa en la pajilla con borde biselado (beveled edge straw; BES) y sus efectos en la viabilidad y el potencial de desarrollo post-desvitrificación. Para la producción in vitro (PIV) de embriones, los ovarios se colectaron en un rastro y se transportaron al laboratorio en solución salina al 0.9%, se puncionaron los folículos de 2-8 mm de diámetro para la obtención de los complejos ovocitos células del cúmulo (COCs), obteniendo un total de 678 COCs, los cuales fueron sometidos a la maduración in vitro (MIV) en el medio TCM-199 por 24 h; tomando aleatoriamente 84 ovocitos para la evaluación de la MIV mediante tinción de Hoechst. La fertilización in vitro (FIV) se llevó a cabo en el medio mTBM con semen descongelado, co-incubando los gametos por 18 h, finalizado este periodo se tomaron aleatoriamente 78 de ellos para evaluar la FIV. Los restantes 516 supuestos cigotos se dividieron en dos grupos: Grupo1: embriones sin vitrificar y desarrollados hasta mórulas en el día 5 post-inseminación, que fueron desarrolladas hasta blastocisto (grupo control). Grupo 2: se incluyeron un total de 421 presuntos cigotos que se dividieron en: grupo 2A: 217 presuntos cigotos para su desarrollo, las mórulas obtenidas se mantuvieron vitrificadas durante 15 días, posteriormente se desvitrificaron para evaluar la viabilidad. El grupo 2B: se incluyeron 204 presuntos cigotos, las mórulas desarrolladas se vitrificaron por el mismo periodo del grupo anterior y se cultivaron por 72 horas para su desarrollo a blastocisto (día 8 post-inseminación) y por 48 horas más para determinar el porcentaje de eclosión. Los resultados fueron los siguientes: En el grupo de mórulas sin vitrificar, la división embrionaria fue de 73.6%, alcanzando un porcentaje de blastocistos de 32.8% y una relación blastocistos/mórulas de 23/36. La viabilidad de las mórulas desvitrificadas fue de 38.7%, mientras que en las mórulas cultivadas post-vitrificación el 27.9% alcanzó el estadio de blastocisto. Finalmente el porcentaje de eclosión de las mórulas que desarrollaron a blastocistos fue de 47.3%. El desarrollo embrionario obtenido en las mórulas no vitrificadas fue acorde a lo reportado en la literatura, demostrando que el protocolo de PIV de embriones es capaz de proveer embriones en estadio de mórula y blastocisto. La BES resultó ser un recipiente adecuado al conservar la viabilidad, recuperación y el potencial de desarrollo embrionario, con la ventaja de ser un recipiente económico y de fácil acceso. El presente trabajo es el primer reporte de mórulas PIV, vitrificadas en BES llegando a obtener la eclosión de los blastocistos. Palabras clave: Fertilización in vitro, mórula, bovinos, vitrificación, etilenglicol, trehalosa, pajilla con borde biselado (BES).
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