Relación del estrés oxidante con la biosíntesis de lovastatina por Aspergillus terreus en fermentación sólida y líquida Público Deposited

This work represents the first attempt to establish a relationship between lovastatin biosynthesis and oxidative stress (EOX), through generation of Reactive Oxygen Species (ROS). In addition, an effort was made to establish the possible mechanism by which ROS can regulate the biosynthesis of this secondary metabolite produced by the fungus Aspergillus terreus. Lovastatin has great commercial and pharmaceutical importance due to its anticholesterolamic properties. Commonly, lovastatin is produced by Submerged Fermentation (SmF), but Solid-State Fermentation (SSF) has become in an alternative process for industrial production. It is known that lovastatin biosynthesis is regulated by catabolic repression; however, studies in SSF have made apparent that there are other mechanisms of regulation, since higher lovastatin production is obtained by mycelium growing in SSF, which conducted to the name “Physiology of Solid Medium”. It is currently known that ROS plays an important role in cellular processes and also in fungal differentiation. We considered that the change from trophophase to idiophase is a “metabolic” differentiation. Studies by Miranda et al., (2008) showed that during the trophophase (fast growth phase) sod1 gen (antioxidant enzyme) was strongly expressed, in what we called initially an Oxidative Stress Period (PEO), that occurs just before the start of lovastatin idiophase (production phase). These results conducted to hypothesize the existences of PEO where high quantities of ROS accumulate just before the onset of idiophase. Under this assumption we decided to characterize the redox state in both phases (tropho- and idiophase), and in both culture systems: SSF and SmF, through the measurement of ROS and redox balance (measured by the ratio of GSH/GSSG) kinetics during lovastatin fermentations. However, results showed an important build up of ROS (at the start of lovastatin biosynthesis) that was maintained throughout idiophase. This suggested a relationship between ROS accumulation and biosynthesis of lovastatin on both production systems. Furthermore, we found that the level of ROS was 10 times higher in SmF in relation to the levels of ROS in SSF. Another difference found, between SSF and SmF, was that in idiophase ROS levels were constant in the first system, unlike what was found in SmF where ROS levels showed important fluctuations during culture development. These results suggest that the low and controlled ROS levels, as found in SSF are adequate to achieve good and clear idiophase, particularly good lovastatin production. In both culture systems, the GSH/GSSG ratio indicated that mycelium in trophophase had a more reducing intracellular environment than in idiophase. Interestingly, the GSH/GSSG ratio was four times greater in SSF compared with SmF, which is consistent with smaller quantities of ROS found in SSF. Moreover, the GSH/GSSG ratio indicated that in trophophase there was a more reducing environment than in idiophase. Also, that the GSH/GSSG ratio was four times greater in SSF than SmF during the idiophase, which is coincident whit the fact that was found ROS low quantities than SSF. These findings contradict the existence of a PEO during trophophase, because ROS levels were relatively low during this stage, but there is indeed a coincidence between a start of ROS accumulation and the lovastatin biosynthesis. These results suggest that the high expression of sod1 gen helps the cell contain ROS, maintaining an adequate redox state (reducing) to carry out the cellular functions of development. Results also suggest that the high ROS concentrations in idiophase is a consequence of Ajtyap1 and sod1 down regulation, and that ROS are important for signaling lovastatin biosynthetic genes. We used exogenous antioxidants and oxidants to establish a relationship between ROS and lovastatin production, and to observe their influence on the metabolite biosynthesis. The use of NAC antioxidant (N-acetylcysteine) significantly reduced lovastatin biosynthesis in both culture systems. In SmF, a NAC concentration of ≥10 mM reduced near of 62 % (p˂ 0.05) the lovastatin production level. In this culture we observed a significantly reduction on ROS accumulation levels in idiophase near of 71% (p˂ 0.05). We conducted a linear regression analysis (α≤0.05) to establish a relation between ROS and lovastatin production.

Los resultados mostraron una elevación en la concentración de ROS (justo al iniciarse la biosíntesis de lovastatina) y que se mantuvo durante toda la idiofase. Esto sugirió una relación entre dicha acumulación de ROS y la biosíntesis de lovastatina, en ambos sistemas de producción. Además, se encontró que el nivel de ROS fue 10 veces mayor en FL con respecto a los niveles de ROS en FS. Otra de las diferencias encontradas entre FS y FL, fue que los niveles de ROS en idiofase, fueron constantes en el primer sistema, a diferencia de lo encontrado en FL donde los niveles de ROS mostraron muchas fluctuaciones durante el desarrollo del cultivo. Esto sugiere que niveles bajos de ROS y controlados, como lo encontrado en FS, son adecuados para lograr una buena función fisiológica, en particular, una buena producción de lovastatina. En ambos sistemas de cultivo, el cociente GSH/GSSG indicó que fue en trofofase donde se encontró un estado más reductor que en idiofase. Además, el cociente GSH/GSSG fue 4 veces mayor en FS que en FL durante la trofofase, lo cual es coherente con el hecho de que se hayan encontrado menores cantidades de ROS en FS. Estos hallazgos contradijeron la existencia de un PEO durante la trofofase, ya que los niveles de ROS fueron relativamente bajos en esta etapa, pero se mostró una coincidencia entre el inicio de la acumulación de ROS y la biosíntesis de lovastatina. Estos resultados sugieren que la alta expresión del gen sod1 regula a la baja la producción de ROS, manteniendo así un estado redox adecuado (reductor) para llevar a cabo las funciones celulares del crecimiento. También sugiere que la alta concentración de ROS en idiofase, es importante para señalizar el metabolismo secundario. Para tratar de establecer la existencia del vínculo entre la producción de ROS y lovastatina, se decidió emplear antioxidantes y oxidantes exógenos y observar su influencia sobre la biosíntesis del metabolito. El empleo del antioxidante NAC (N-acetilcisteína), redujo significativamente la biosíntesis de lovastatina en ambos sistemas de cultivo. En FL, concentraciones iguales o mayores a 10 mM de NAC lograron decrementos significativos de hasta del 62% (p ˂ 0.05) en el nivel de producción de lovastatina. En este cultivo, se observaron decrementos significativos con el nivel de acumulación de ROS en la idiofase de hasta el 71% (p˂ 0.05). Un análisis de regresión lineal simple entre ambas variables, mostró un índice de correlación (α≤0.05), para establecer la existencia de una relación entre la producción de ROS y lovastatina. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una estrecha relación entre ambas variables (R2 =0.93, p˂ 0.05). En FS, concentraciones de NAC hasta de 100 mM, redujeron tanto la producción de lovastatina como de ROS, hasta un 79% y 53% respectivamente (p˂ 0.05), obteniéndose un índice de correlación muy estrecho entre ambas variables (R2 =0.99; p˂ 0.05). Un análisis de Northern de los genes lovE y lovF, reveló que el tratamiento con NAC influyó de negativamente sobre la expresión de ambos genes. En FS se observó un decremento promedio en la expresión del gen lovE, del 35 y 50% con 50 y 100 mM de NAC respectivamente. Mientras que con las mismas concentraciones de NAC, se observó un decremento en la expresión de lovF del 25 y 35% respectivamente. En forma coincidente, el empleo de 10 y 50 mM de NAC en FL, ocasionó decrementos promedio en la expresión de lovE del 35 y 50% , y en el caso de lovF fueron del 15 y 35% respectivamente. Estos datos demuestran que las ROS no sólo son necesarios para la producción normal de lovastatina, sino que contribuyen a la regulación transcripcional de los genes de la ruta biosintética de lovastatina, incluyendo al gen regulador lovE.

The results obtained suggest the existence a good relation between ROS and lovastatin production (R2 =0.93, p˂ 0.05). In SSF, NAC concentrations up to 100 mM, reduced both, lovastatin and ROS production, up to 79 and 53 % respectively (p˂ 0.05), to yield an correlation index very close between variables (R2 =0.99, p˂ 0.05). 8 Northern analysis of genes lovE and lovF revealed that treatment with NAC (and hence lower ROS levels) had a negative influence on both genes expression. With the use of 50 and 100 mM of NAC concentration, in SSF we observed a decrease in expression of gen lovE in rates of 35 and 50% respectively, while with the same NAC concentrations we observed a decrease in expression of gen lovF in rates of 25 and 35 % respectively. Concurrently, the use of 10 and 50 mM NAC in SmF, caused decreases in lovE expression in rates of 35 and 50%, and in the case of lovF were 15 and 35% respectively. These data show that ROS are not only necessary for the normal production of lovastatin, but contribute to transcriptional regulation of the biosynthetic genes of lovastatin, including lovE regulatory gene, although the mechanism is still unknown. On the other hand, we observed the response of lovastatin biosynthesis using the oxidants H2O2 and paraquat in solid culture in petri dish (CP), SSF and SmF. In CP, results showed significant increases. The use of H2O2 150 mM, showed an increase of 233.3% relative to control (p˂ 0.05), whereas with paraquat (1, 10 and 25 mM concentrations), increases were achieved (64, 149 and 106 % (p˂ 0.05) respectively). However, in SmF the use of H2O2 had no effect on the lovastatin production. Moreover, in SSF, the use of 10 and 50 mM H2O2 decreased biomass and lovastatin biosynthesis. This suggests that ROS levels must be tightly regulated. In order to establish a possible mechanism by which ROS exert their action on lovastatin biosynthesis, we analyzed the promoters of lovF and lovE genes (1000 bp upstream of the translation start codon) and found multisite binding sites (putative) for transcriptional factors (TFs) that are related to various cellular functions, but mostly oxidative-stress-related TFs that match both yeast and mammals. Thus, binding sites for AP-1 (in fungi Yap1) Skn7 (or SrrA), Msn2/Msn4, NF-κ-B, NRF2, etc were found. This suggested that the lovastatin biosynthesis can be regulated by transcription factors that respond to EOX Northern analysis suggested that Atyap1 can regulate sod1 gene, as observed similar expression patterns. It has been reported that Sod1p is regulated through Yap1p in yeast, and in silico analysis performed in sod1 promoter region of A. terreus confirmed the existence of putative binding sites for AP-1 (orthologous of Yap1p). In turn, the promoter region of lovE gene, presented these binding sites, suggesting that ROS could regulate secondary metabolism through Atyap1p. An effort was made to try and elucidate the mechanism by which ROS modulate the lovastatin biosynthesis, and Atyap1, was silenced, using pGdpPki-RNAi vector. The transformants showed a marked sensitivity to H2O2, also showed an early and high sporulation. Preliminary results also showed a precocious and elevated level of lovastatin. It has been reported that Yap1 can Yap1p positively and negatively modulate different EOX response genes. Therefore, it is proposed that AtYap1 positively regulates Sod1, but negatively lovastatin pathway genes. i.e. lovE. These results are not conclusive, but a wedge to discuss whether this mechanism by which lovastatin biosynthesis can be regulated. In another analysis we fount the existence of several binding sites for transcription factor SrrA (Skn7) in the promoter regions of lovE and lovF. Northern-blot analysis was performed and the expression profile of srrA gene (homologous to Skn7), during lovastatin fermentation, was obtained, (Mendoza et al., in review). In SSF in this gene was expressed during idiophase while in SmF, apparently expressed throughout tropho- and idiophase of lovastatin, but at points of time lapses apparently expression. This expression pattern, together with the discovery of the multiple binding sites of this transcriptional factor, found in the promoters of the pathway suggests that SrrA also can play an important role in controlling the production of lovastatin, perhaps explaining the particularities biosynthesis in SSF.

Por otra parte, se observó la respuesta de la biosíntesis de lovastatina con el empleo de oxidantes como H2O2 y paraquat en cultivo sólido en Caja de Petri (CAJA DE PETRI), FS y FL; y fue en CAJA DE PETRI donde se lograron aumentos significativos de producción. El empleo de H2O2 150 mM aumentó la producción de lovastatina 233.3% (p˂ 0.05) respecto al control, mientras que con paraquat, el empleo de 1, 10 y 25 mM, aumentaron la biosíntesis del metabolito, 64, 149 y 106% (p˂ 0.05) respectivamente. Por otra parte, en FL el empleo de H2O2 no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento y la biosíntesis Finalmente en FS, el empleo de H2O2 redujo tanto la biosíntesis de biomasa como de lovastatina con el empleo de 10 y 50 mM del oxidante. Lo anterior sugiere que los niveles de ROS deben ser finamente regulados, además, las ROS generadas en ciertos tiempos y por ciertos mecanismos (desconocidos) son las que podrían influir en la biosíntesis de este metabolito. Para tratar de establecer el mecanismo por el cual las ROS regulan la biosíntesis de lovastatina, se analizaron los promotores de los genes lovE y lovF (1000 pb corriente arriba del codón de inicio de traducción), y se encontraron múltiples sitios de unión (probables) a Factores Transcripcionales que se relacionan con distintas funciones celulares, pero en su mayoría, con Factores Transcripcionales que responden a EOX tanto en hongos como en mamíferos. Así, se encontraron sitios de unión a AP-1 (en hongos Yap1), Skn7 (o SrrA), Msn2/Msn4, NF-κ-B, NRF2, etc. Esto indica que la biosíntesis de lovastatina puede ser regulada a través de factores transcripcionales que responden a EOX. El análisis de Northern realizado en micelio proveniente de la fermentación de lovastatina (FS y FL) sugirió que AtYap12 puede a su vez regular al gen sod1, ya que se observaron patrones de expresión similares. Se ha reportado que Sod1p es regulado a través de Yap1p en levadura, y un análisis in silico, realizado en esta tesis, para el gen sod1 de A. terreus confirmó la existencia de sitios putativos de unión para AP-1 (ortólogo de Yap1p). A su vez, el promotor del gen lovE presentó dichos sitios de unión, sugiriendo que una posibilidad de mecanismo de regulación podría estar relacionado con Yap1p. Considerando la presencia de sitios putativos para Yap1p en el promotor de los genes de lovastatina, se realizaron una serie de experimentos para tratar de dilucidar el mecanismo por el cual las ROS modulan la biosíntesis de lovastatina, por medio del silenciamiento del gen que codifica para este Factor Transcripcional, empleando el vector pGdpPki-RNAi. Las mutantes con Atyap1 silenciado, mostraron una marcada sensibilidad al H2O2, además presentaron una producción precoz y elevada de esporas respecto a la parental. Resultados preliminares mostraron también biosíntesis precoz y elevada de lovastatina, relacionando a este gen con el metabolismo secundario. Se ha reportado que Yap1p puede modular de manera positiva y negativamente diferentes genes de respuesta a EOX, por lo que se propone que AtYap1 podría regular positivamente a sod1, pero negativamente a los genes de la vía, particularmente lovE. Estos resultados no son concluyentes, pero abren una brecha para indagar si es por este mecanismo por el cual la biosíntesis de lovastatina puede ser regulada. En otro análisis, y debido a la existencia de varios sitios probables de unión a Skn7, se analizó por Northern-blot el perfil de expresión del gen srrA (homólogo a skn7) durante una cinética de producción de lovastatina. En FS, este gen se expresó sólo durante la idiofase, mientras que en FL, se expresó durante toda la trofo- e intermitentemente durante la idiofase de lovastatina. Este patrón de expresión, aunado al hallazgo de los múltiples sitios de unión de este Factor Transcripcional, encontrados en los promotores de la vía, sugiere que también srrA puede jugar un papel importante en el control de la producción de lovastatina, y quizás explicar particularidades de la biosíntesis en FS.

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