Caracterización bioquímica, fisicoquímica y dinámica de migración de dos proteínas espermáticas porcinas con afinidad a zona pelúcida homóloga Público Deposited
Aunque generalmente se ha aceptado que ZP3 (componente 3 de la zona pelúcida) es la principal proteína del ovocito que es la responsable de la unión primaria entre el ovocito y el espermatozoide en la mayoría de las especies, la identificación del receptor complementario sobre la superficie de los espermatozoides se ha mantenido controvertido. Actualmente se ha propuesto el concepto de múltiples proteínas espermáticas que actúan en coordinación para facilitar los complejos eventos que ocurren durante el reconocimiento entre gametos de mamíferos. La cantidad de proteínas y jerarquía con la que éstas coordinan el fenómeno de reconocimiento especie-específico es actualmente poco claro. En esta tesis, se muestra la purificación de dos proteínas espermáticas porcinas con afinidad a ZP por medio de cromatografía de afinidad ―la acrosina y la lactadherina― de las cuales se analiza la estructura secundaria obtenida por dicroísmo circular (DC), así como la cinética de migración determinada por microscopía electrónica, antes y después de la capacitación espermática. El análisis de los espectros de DC de ambas proteínas muestran que el patrón de plegamiento que sigue la lactadherina es del tipo α+β, mientras que la acrosina muestra el tipo α. Esto demuestra que se trata de dos proteínas de adhesión diferentes en su estructura secundaria. El análisis de la localización antes y después de la capacitación, pudo ser determinado solamente para la acrosina, de la cual se confirmó que está ubicada en el interior del acrosoma al observar marcaje solamente cuando algunas membranas se mostraban dañadas después de 4 h de capacitación. Puesto que la lactadherina es una proteína novedosa de adhesión en el espermatozoide porcino y dado que su concentración es minoritaria, en esta tesis se demostró que puede ser sustituída por aquella obtenida abundantemente en la leche de la misma especie o bien, por la lactadherina de leche bovina, con quienes se comparó la secuencia completa de aminoácidos. Los resultados de esta última parte del trabajo demuestran que las lactadherinas porcina y bovina encontradas abundantemente en la fracción grasa de la leche puede ser usada como análogo disponible de la lactadherina de origen espermático ya que: (1) mostró afinidad por la ZP porcina, (2) su secuencia de aminoácidos tienen un alto porcentaje de identidad con aquella presente en los espermatozoides y (3) el análisis de sus espectros presentan el mismo patrón de plegamiento (tipo α+β). Debido a estas características y por razones de cantidad y disponibilidad, la lactadherina de leche bovina puede ser la proteína de elección para estudiar el reconocimiento entre gametos porcinos.
Although generally has been accepted that ZP3 (component 3 from zona pellucida) is the main responsible sperm-oocyte binding protein present in the most of species, identification of complementary receptor on surface from sperm, it has been debatable. Currently, it has been proposed the concept of multiple sperm proteins that act in coordinated manner to facilitate the complex events that occur during recognition between mammal gamets. The quantity of protein and hierarchy which they coordinate the species-specific recognition fenomenon is currently few clear. In present thesis, it is shown the purification from two pig sperm proteins with affinity of ZP by means of affinity chromatography ― acrosina and lactadherin―from which it is analized the secondary structure obtaines from circular dichroism (CD), as well as the kinetic of migration by electronic microscopy, before and after sperm capacitation. Analysis of CD spectra from both proteins show that folding pattern is type α+β for lactadherin, while acrosin show a pattern type α. This shows that is a matter of two different identifying adhesion proteins as for its secondary structure. Analysis of localization before and after capacitation, it could be determined only for acrosin, of which was confirmed that is located inside the acrosome to observe marking only when some membranes they were shown damaged after 4 h capacitation. Lactadherin —a novel adhesion protein from pig sperm— being a minority protein, can be replaced for that one obtained abundantly from milk of same species as well as from bovine milk lactadherin, with which ones, the primary structure it was compared. The results of this last part of research showing that the pig and bovine lactadherins, abundantly found in the milk fat fraction can be used as suitable analogs of sperm origin lactadherin for the following reasons: (1) The affinity for the ZP, (2) the fact that the primary sequence of both milk lactadherins is highly homologous as well as being homologous with the spermatic lactadherin and (3) the secondary structures for both milk lactadherins present the same folding pattern (type α+β). Due to this evidence and to quantity and availability reasons, the bovine lactadherin may be the selected protein for future studies as a recognition molecule between porcine gametes.
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