Estudio del efecto antimicrobiano de bacteriocinas del genero Enterococcus y Pediococcus en la membrana celular de Listeria innocua ATCC33090 - Aguado Bautista, Luis Arturo (Universidad Autónoma Metropolitana, 2013)
The use of biological products to inhibit or destroy pathogens involves a biotechnological approach that is part of the concept of antimicrobial hurdles and aims eventually obtaining safer food for consumers. Because lactic acid bacteria (LAB) have been used to development of a wide range of fermented foods for centuries, they are generally regarded as GRAS (Generally Recognized As Safe), so they can use them as bio-conservatives or microbial biocontrols. There has been a great interest for using Enterococcus and Pediococcus strains as starter cultures in the fermented dairy and meat products production since the 20th century, as they contribute to product stability, the development of final product specific sensory properties, also, their ability to produce bacteriocins, among other bacteriostatics compounds. However, the strains of Enterococcus, Pediococcus and their bacteriocins should be biochemical and molecularly characterized before a possible application in foods. Therefore, the aim of this study was to determine the effect of bacteriocins produced by Enterococcus faecalis MXVK22, Enterococcus faecium MXVK29 and Pediococcus parvulus MXVK133 on Listeria innocua ATCC33090 strain. Bacteriocins were extracted from cultures of E. faecium MXVK29, E. faecalis MXVK22 and P. parvulus MXVK133 also Nisin was used as a control. The antimicrobial activity of bacteriocins and the minimum inhibitory concentration (MIC) were determined, against Listeria innocua ATCC33090 load of 7-8 log CFU / mL was measure. Likewise, different bacteriocins were separately added based on their MIC against sensitive strain and the leakage of intracellular material was quantified. Also, the post-exposure bacteriocins recovery ability of sensitive strains was evaluated. Moreover, sensitive cells were labeled with diacetate 5 (6)-carboxyfluorescein (CFDA) in order to corroborate the intracellular material flow. Kinetics were performed by exposure the cell to the bacteriocin, as well as a standard account to determined bacteriostatic effect on treated cells with the bacteriocin, finally the cells was observed in transmission electron microscope to perceived directly the effect caused. None of the bacteriocins applied to Listeria innocua presented the same action mode of nisin, as in all the tests that were evaluated. Nisin was the most efficient to cause inactivation of Listeria cells in all treatments. The three bacteriocins used cause leakage of intracellular material and marker, however the enterocin 29 was the most effective of the three that were assessed to have an inhibitory activity of 43.03 AU / mg of protein and an MIC of 7.81 mg / mL, achieving a reduction of Listeria 1-2 log units, whereas nisin was a reduction of 5-6 log units when their MIC was used 0.78 mg / mL. Also the leaking intracellular material using the enterocin 29 was greater than enterocin 22 and pediocin 133. Therefore, it was concluded that the action mechanism of bacteriocins produced by Enterococcus faecalis MXVK22, Enterococcus faecium MXVK29 and Pediococcus parvulus MXVK133 was type IIa as classified by Cotter et al conducted in 2005; La utilización de productos biológicos para inhibir o destruir a microorganismos patógenos, implica un enfoque biotecnológico que forma parte del concepto de barreras antimicrobianas y que tiene como objetivo final la obtención de alimentos más seguros para el consumidor. Debido a que las bacterias ácido lácticas (BAL) han sido usadas por siglos en la elaboración de un amplio número de alimentos fermentados, ellas son generalmente consideradas como GRAS (Generally Recognized As Safe) por lo que resultan ideales para su uso como bioconservadores o biocontroladores microbianos. Desde el siglo 20 ha existido un gran interés por emplear cepas de Enterococcus y Pediococcus como cultivos iniciadores en la elaboración de productos cárnicos y lácteos fermentados, debido a que éstos contribuyen en la estabilidad del producto, en el desarrollo de las propiedades sensoriales específicas del producto final, además de su capacidad para producir bacteriocinas, entre otros compuestos bacteriostáticos; sin embargo antes de su posible aplicación en alimentos las cepas de Enterococcus, Pediococcus y sus bacteriocinas deben ser caracterizadas bioquímica y molecularmente. Por este motivo el objetivo de este trabajo, fue determinar el efecto de las bacteriocinas producidas por Enterococcus faecalis MXVK22, Enterococcus faecium MXVK29 y Pediococcus parvulus MXVK133, sobre una cepa sensibilizada de Listeria innocua ATCC33090. Las bacteriocinas fueron extraídas de cultivos de E.faecium MXVK29, E.faecalis MXVK22 y P. parvulus MXVK133, también se utilizó Nisina como control. Se les realizaron determinaciones de actividad antimicrobiana a los diferentes extractos; posteriormente se procedió a la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de las bacteriocinas contra una carga microbiana de 7-8 log UFC/mL de Listeria innocua ATCC33090. Se adicionaron las diferentes bacteriocinas por separado en base a su CMI, contra la cepa sensible y se determinó la fuga del material intracelular, así como la evaluación de la capacidad de recuperación posterior a la exposición de las bacteriocinas. Por otra parte las células sensibles fueron marcadas con diacetato de 5(6)- carboxifluoresceina (CFDA), para corroborar el flujo de material intracelular y fueron realizadas cinéticas por exposición a la bacteriocina, así como un recuento en placas de agar cuenta standard para determinar el efecto bacteriostático y finalmente se procedió a la observación de las células tratadas con las bacteriocinas en un microscopio electrónico de transmisión, para observar directamente el efecto causado. Ninguna de las bacteriocinas aplicadas sobre Listeria innocua presento el mismo mecanismo de acción de la Nisina, ya que en todas las pruebas en las que fueron evaluadas, la Nisina fue la más eficiente, al causar la inactivación de las células de Listeria. Las tres bacteriocinas utilizadas causan la fuga del material intracelular así como del marcador, sin embargo la enterocina 29 fue la más eficaz de las tres que se evaluaron al poseer una actividad inhibitoria de 43.03 UA/µg de proteína y una CMI de 7.81 mg/mL, logrando una reducción de 1 a 2 ciclos logarítmicos de Listeria, mientras que la nisina logró una reducción de 5 a 6 ciclos logarítmicos cuando se usó su CMI de 0.78 mg/mL. A su vez la enterocina 29 logró que la cantidad de material intracelular fugado sea mayor respecto a la enterocina 22 y pediocina 133. Por lo tanto, se concluye que el mecanismo de acción de las bacteriocinas producidas por Enterococcus faecalis MXVK22, Enterococcus faecium MXVK29 y Pediococcus parvulus MXVK133 respectivamente, es del tipo IIa según la clasificación de Cotter et al realizada en el 2005.