Mecanismos de desplegamiento y replegamiento térmicos de la enzima dimerica triosafosfato isomerasa de levadura - Benítez Cardoza, Claudia Guadalupe (Universidad Autónoma Metropolitana, 2001)
En el presente trabajo se estudió el desplegamiento térmico de la triosafosfato isomerasa (TIM) de levadura empleando para ello calorimetría diferencial de barrido y métodos espectroscópicos tales como dicroísmo circular (DC) y fluorescencia. Primeramente se buscaron condiciones de reversibilidad en las transiciones de desplegamiento térmico seguidas por DC, siendo éstas: pH 8.5, concentraciones de proteína menores a 0.150 mg mL-1 y velocidades de barrido mayores a 1 oC min-1 . A pesar de que los barridos de desplegamiento térmico fueron reversibles, los ciclos de desplegamientoreplegamiento presentaron una marcada histéresis. Por otro lado, se realizaron estudios cinéticos utilizando las técnicas de DC y fluorescencia. Con ellos se probó que el desplegamiento consiste, inicialmente, de una reacción de primer orden, que conlleva a la formación de un estado térmicamente desplegado, U. A juzgar por la señal de DC, U contiene estructura secundaria residual pero carece de la mayoría de las interacciones terciarias presentes en la proteína nativa. U puede formar un estado irreversiblemente desplegado (probablemente por agregación) si permanece expuesto durante períodos prolongados a temperaturas altas. En contraste, si se enfría rápidamente el estado U es capaz de replegarse hasta la forma nativa a través de una cinética de segundo orden. A partir de los resultados obtenidos en las cinéticas de replegamiento seguidas por DC se observó que la unión de los monómeros del estado U para formar la TIM nativa está asociada a la recuperación de estructura secundaria Asimismo, se determinaron los parámetros de activación de los procesos de desplegamiento y replegamiento. El Hu de activación determinado fue alto (480 kJ mol-1 ) comparado con lo reportado para varias proteínas monoméricas. El valor de Cp ‡ u es prácticamente insignificante (2.1 ± 5.9 kJ mol-1 K -1 ). Por el contrario, el replegamiento muestra un valor muy grande y negativo de Cp ‡ r (-31 ± 7 kJ mol-1 K -1 ), lo que concuerda satisfactoriamente con lo publicado para varias proteínas monoméricas. La dependencia de las constantes cinéticas de desplegamiento y replegamiento con la temperatura podría ser una probable explicación de la histéresis observada en los barridos térmicos.