Modelación molecular para determinar la interacción de las proteínas de leche con la aflatoxina M1 Público Deposited

In the present work, the evaluation of the interaction of aflatoxin M1 (AFM1) with milk protein α-lactalbumin (α-LA) by spectroscopic methods was performed to determine the thermodynamic parameters: binding constant (Kb) and binding free energy (ΔGb), as well as describe the nature of the interaction by calculating the changes in enthalpy (ΔH) and entropy (ΔS) also with the molecular docking was modeled the binding site of AFM1 with the crystallographic structure of α-LA obtained at pH 6. 5. Besides, with β-lactoglobulin (β-LG) structural models at pH 2.0, 6.5, 7.4 and 8.2 was modeled the binding form of AFM1 at the three reported binding sites: the Calyx, Site C and the dimer interface, the latter was only studied at pH 6.5 and 7.4. These evaluations were carried out in order to describe the affinity of milk proteins for AFM1 by means thermodynamic parameters, as well as to predict the possible binding sites. With the fluorescence spectroscopy results, it was determined that AFM1 presents hydrophobic interactions with α-LA obtaining a Kb of (2.12 ± 0. 59) x 103 M-1 and a ΔGb of - 19.17 ± 0.96 kJ mol-1, furthermore, circular dichroism spectra showed that there are changes in the ordering of the secondary structures α-helices and β-sheet upon addition of the mycotoxin, whereby it can be assumed that as the concentration of AFM1 is increased the α-LA-AFM1 complex stabilizes. According to the molecular docking, it was observed that the mycotoxin binds in the hydrophobic regions of the α-LA: hydrophobic box and the aromatic group I with a ΔGb of - 26.07 and -26.28 kJ mol-1, respectively. For the case of the β-LG when performing the comparison of the structures at the four pH, it was observed that in the Calyx at pH 2.0 and 6.5 the EF loop was found in the closed conformation and the area of the Calyx cavity is more reduced compared to pH 7.4 and 8.2 in which the EF loop is open. In the Site C region, it was observed that at pH 2.0 a hydrophobic cavity is formed which decreases as the pH increases obtaining a hydrophilic nature. Despite these structural changes, AFM1 formed a complex with all four structures of the β-LG at different pH. Finally, it was determined that the complexes formed of β-LG-AFM1 at pH 6.5 showed no differences in binding parameters with a ΔGb of -29.71, -28.70 and -28.03 kJ mol-1 at the Calyx, Site C, and dimer interface, respectively. As can be seen, the ΔGb of the complexes formed with the two proteins at pH 6.5 is similar, so it can be assumed that the affinity of α-LA and β-LG for AFM1 is similar. Furthermore, because the pH of milk is 6.8, it can be concluded that milk proteins are capable of transporting AFM1. Also, the variation of mycotoxin concentration in curd and whey during cheese making can be partly explained by the variation of the affinity of β-LG at different pH.

En el presente trabajo se realizó la evaluación de la interacción de la aflatoxina M1 (AFM1) con la proteína de la leche α-lactoalbúmina (α-LA) por métodos espectroscópicos para determinar los parámetros termodinámicos: constante de unión (Ku) y energía libre de unión (ΔGu) así como describir la naturaleza de la interacción al calcular los cambios en la entalpía (ΔH) y entropía (ΔS), asimismo con la herramienta de acoplamiento molecular se modelo el sitio de unión de la AFM1 con la estructura cristalográfica de la α-LA obtenida a un pH de 6.5. Además, con diferentes modelos estructurales de la β-lactoglobulina (β-LG) a diferentes pH: 2.0, 6.5, 7.4 y 8.2 se modelo la forma de unión de la AFM1 en los tres sitios de unión reportados: el Cáliz, Sitio C y la interfaz del dímero, este último solo se estudió a pH 6.5 y 7.4. Estas evaluaciones se llevaron a cabo con la finalidad de describir la afinidad que presentan las proteínas de la leche por la AFM1 por medio de los parámetros termodinámicos, así como predecir los posibles sitios de unión. Con los resultados de espectroscopía de fluorescencia se determinó que la AFM1 presenta interacciones hidrofóbicas con la α-LA obteniendo una Ku de (2.12 ± 0.59) x 103 M-1 y una ΔGu de -19.17 ± 0.96 kJ mol-1, además, los espectros de dicroísmo circular mostraron que hay cambios en el ordenamiento de las estructuras secundarias α-hélices y hojas β al adicionar la micotoxina, con lo que se puede asumir que conforme se aumenta la concentración de la AFM1 el complejo α-LA-AFM1 se estabiliza. Con la herramienta de acoplamiento molecular se observó que la micotoxina se une en las regiones hidrofóbicas de la α-LA: caja hidrofóbica y grupo aromático I con una ΔGu de -26.07 y -26.28 kJ mol-1, respectivamente. Para el caso de la β-LG al realizar la comparación de las estructuras a los cuatro pH, se observó que en el Cáliz a pH de 2.0 y 6.5 el loop EF se encuentra en conformación cerrada y el área de la cavidad del Cáliz está más reducida en comparación a los pH 7.4 y 8.2 en los cuales el loop EF está abierto. En la región del Sitio C, se observó que a un pH 2.0 se forma una cavidad hidrofóbica, la cual va disminuyendo conforme se aumenta el pH obteniendo una naturaleza hidrofílica. A pesar de estos cambios estructurales la AFM1 formó complejo con los cuatro modelos estructurales de la β-LG a los diferentes pH. Finalmente, se determinó que los complejos formados de β-LG-AFM1 a pH de 6.5 no presentaron diferencias en los parámetros de unión con una ΔGu de -29.71, -28.70 y -28.03 kJ mol-1 en el Cáliz, Sitio C e interfaz del dímero, respectivamente. Como se puede observar las ΔGu de los complejos formados con las dos proteínas a un pH de 6.5 son similares, por lo que se puede asumir que la afinidad de la α-LA y β-LG por la AFM1 es similar. Además, debido a que el pH de la leche es 6.8, se puede concluir que las proteínas de la leche son capaces de transportar la AFM1. Asimismo, la variación de la concentración de la micotoxina en la cuajada y el suero de leche durante la elaboración de queso puede ser explicada en parte por la variación de la afinidad que presentó la β-LG a diferentes valores de pH.

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  • 2021
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Última modificación: 10/05/2022
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