Identificación de la actividad antimicrobiana de cepas bacterianas del género Enterococcus - Reyes Cortés, José Luis (Universidad Autónoma Metropolitana, 2015)
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son usadas como cultivos iniciadores para conservar los alimentos, ya que producen una amplia gama de metabolitos antibacterianos como: ácidos orgánicos, bacteriocinas y peptidoglucano hidrolasas (PGH). Estas últimas enzimas hidrolizan los enlaces glucosídicos o peptídicos que se encuentran en el peptidoglucano presente en la pared celular de todas las bacterias, produciendo la lisis celular. Además están implicadas en diversas funciones celulares, tales como el crecimiento, la división y la autolisis. En particular, las BAL del genero Enterococcus son frecuentemente utilizadas en productos cárnicos como cultivo iniciador, y se ha reportado que tienen la capacidad de inhibir algunos microorganismos patógenos. Las cepas Enterococcus faecium UAMI-3 y Enterococcus faecium MXVK22 fueron aisladas de chorizo tipo español y chorizo tipo mexicano, respectivamente. Estas cepas presentan actividad antimicrobiana contra diferentes bacterias patógenas, aunque se desconocía la naturaleza de los metabolitos responsables de dicha actividad, por lo que el objetivo de este trabajo fue caracterizar el o los compuestos con actividad antimicrobiana producidos por cepas de Enterococcus En primer lugar se confirmó el género y especie de las cepas de estudio mediante la secuenciación del ARNr 16S y se determinó la actividad antimicrobiana total por la prueba de difusión en agar contra diferentes microorganismos patógenos y BAL. Posteriormente se realizó la extracción de proteínas por la técnica de adsorción-desorción (que favorece la extracción de péptidos catiónicas como las bacteriocinas) y por precipitación con ácido tricloroacético (TCA por sus siglas en inglés) para su posterior identificación por LC- MS/MS. Por otra parte se verificó la presencia de los genes que codifican para las proteínas causantes de la actividad antimicrobiana como son: la enterocina A (entA), enterocina B (entB) y PGHs, y adicionalmente se obtuvo el ADN complementario (ADNc) del gen entA a partir de la extracción de ARN total de las cepas UAMI-3 y MXVK22, y se realizó una amplificación con primers específicos para verificar la presencia de la enterocina A. Se obtuvo una similitud del 100% con Enterococcus faecium y del 98-100% con los genes que codifican para la enterocia A, la proteína P54 y N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa para ambas cepas. En los extractos obtenidos por la técnica adsorcióndesorción se identificó la proteína fosfoacetil transferasa y la proteína L5 50S ribosomal para la cepa UAMI-3 y MXVK22 respectivamente, aunque ninguna de las dos está asociada con la actividad antimicrobiana, con respecto a la secuencia obtenida con el ADNc se obtuvo una similitud de 100% con el gen entA, aunque no se observa actividad antimicrobiana en los zimigramas. Con respecto a los extractos obtenidos con TCA se identificaron las proteínas P54 (56.4 kDa) y N-acetilmuramoilL-alanina amidasa (70.4 kDa) para la cepa MXVK22; mientras que para la cepa UAMI-3 sólo se identificó a la proteína P54 (57.7 kDa). Estas proteínas mostraron actividad antimicrobiana y se sabe que están asociadas a la hidrolisis de la pared celular, por lo que se procedió a determinar la concentración mínima inhibitoria de las mismas por medio de la técnica de difusión en agar contra Staphylococcus aureus y Listeria innocua. La CMI contra L. innocua fue de 10 µg/mL y contra S. aureus fue de 20 µg/mL, siendo los mismos resultados para los extractos de las cepas UAMI-3 y MXVK22. Por todo lo antes mencionado se determinó que la actividad antimicrobiana presente en las cepas E. faecium UAMI-3 y E. faecium MXVK22 se debe a la producción de peptidoglucano hidrolasas (P54 y N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa) y no a bacteriocinas, ya que aunque las dos cepas presentan el gen entA que codifica para la enterocina A y que este se transcribe a ARNm, posiblemente no se lleva a cabo la traducción o el péptido no realiza los cambios pos-traduccionales que le proporcionan la actividad antimicrobiana. Finalmente la actividad observada de N-acetilglucoamidasa es de interés en la industria de los alimentos y la biotecnología, ya que puede ser utilizada para el control de patógenos alargando la vida de anaquel de productos alimenticios. ; Lactic Acid Bacteria (LAB) as starter cultures are used to preserve processed foods because they produce a wide range of antibacterial metabolites such as organic acids, bacteriocins and peptidoglycan hydrolase (PGH). The latter enzymes hydrolyze glycosidic linkages or peptide found in the peptidoglycan of all bacteria, producing cell lysis, they are also involved in various cellular processes such as growth, division and functions autolysis. The LAB of the genus Enterococcus are used in meat products as starter culture, and has been reported to have the ability to inhibit pathogens. Enterococcus faecium UAMI-3 and Enterococcus faecium MXVK22 were isolated from Mexican and Spanish chorizo sausage type respectively, and identified the supernatant of these strains showed antimicrobial activity against various pathogenic bacteria. Due to the lytic effect of these strains of pathogenic bacteria as it is not the nature of the activity is known, the aim of this study was to identify the compound or compounds causing such activity, the spectrum of inhibition and its minimum inhibitory concentration (MIC). First total antimicrobial activity by agar diffusion test against different pathogens and microorganisms BAL was determined, subsequently identifying the genes coding for enterocin A (entA) and enterocin B (entB) was performed on both strains study, obtaining a PCR amplification product for the entA gene in both strains studied. After protein extraction was performed by adsorptiondesorption technique favoring cationic protein extraction as bacteriocins extracted proteins were identified by LC-MS / MS. Fosfoacetil transferase protein in the extract of strain 3 and 50S ribosomal protein in the extract was identified strain MXVK22, both not associated with antimicrobial activity. Was carried out protein extraction with trichloroacetic acid, the antimicrobial activity is determined by inhibiting pathogenic bacteria and BAL. They were identified by LC-MS MS two proteins in the extract of the strain MXVK22 associated with antimicrobial activity, protein P54 with a weight of 56.4 kDa and N-acetilmuramoil-L-alanine amidase weight 70.4 kDa protein and P54 equal weight 57.7 kDa extract strain UAMI3, both strains associated with cell wall hydrolysis. The minimum inhibitory concentration by the agar diffusion method against S. aureus and L. innocua be determined CMI 10 ug / mL against L. innocua and 20 mcg / mL against S. aureus these results were the same extracts for both strains UAMI-3 and MXVK22. Then he held for molecular identification UAMI-3 and MXVK22 strains of genes encoding proteins that cause antimicrobial activity, obtaining sequences with identity of amidase protein P54 and N-L-alanine-acetilmuramoil strains of the genus Enterococcus in the genome of both strains. Was performed RNA extraction conversion to complementary DNA (cDNA) and amplification of entA cDNA gene such as mold and entA gene sequence in both strains was obtained UAMI-3 and MXVK22. For all the above is It determined that the antimicrobial activity present in strains Enterococcus faecium Enterococcus faecium UAMI-3 and MXVK22 is due to peptidoglycan hydrolases (P54 and N-acetilmuramoil-L-alanine amidase) and not bacteriocins. Thus both strains exhibit also the gene (entA) encoding enterocin A and that this RNA is transcribed but not performed the translation of said protein transcribed. observed activity is N-acetilglucoamidasa interest in the food industry and biotechnology, as it can be used as lysozyme to control pathogens, extending the shelf life of food products.