Efecto de la temperatura y disolventes orgánicos sobre la actividad de la enzima lacasa de Myceliophthora thermophila modificada con polietilenglicol Público Deposited

En esta tesis se investigó el efecto de la conjugación en la enzima lacasa (EC 1.10.3.2) con polietilen glicol (PEG) y de su estabilidad frente al calentamiento con diferentes solventes, como el agua y sus mezclas con el metanol, etanol y propanol comparándola con la enzima sin conjugación. La enzima lacasa nativa fue extraída y purificada a partir del polvo Deni Lite IIs, comercializado por la empresa Novo Nordisk y producida a través de la expresión heteróloga del gen de la lacasa del hongo termofílico Myceliophthora thermophila (MtL) en el hongo Aspergillus oryzae (Berka y col. 1997). La enzima fue conjugada a través del acoplamiento covalente de cadenas de metoxi polietilen-glicol (PM=5000) (mPEG5000) y se etiquetó como MtL-PEG5000. La enzima nativa tuvo un PM de 80 kDa, que fue determinado por cromatografía de filtración en gel y de 110 kDa por SDS-PAGE. La dimerización oxidativa del 2,6 dimetoxifenol (DMP), para producir la correspondiente dibenzoquinona, fue catalizada por MtL en una forma comparable a las reacciones controladas por difusión (kcat/KM≅108 M-1 s-1 y Ea≅18 kJ/mol). Por titulación de los grupos ε-amino en los residuos de lisina con el ácido picríl sulfónico (TNBS), en la enzima MtLPEG5000 se cuantificó que se encuentran bloqueados con mPEG5000 54% de los grupos, con lo cual sus propiedades hidrodinámicas y de carga fueron diferentes a las mostradas por la enzima MtL. La eficiencia catalítica (kcat/KM) de la enzima conjugada fue similar a la que se determinó en la enzima original, utilizando como sustrato enzimático el compuesto 2,6-dimetoxifenol (DMP); sin embargo, kcat/KM disminuyo 2 veces para la reacción de oxidación catiónica con ácido 2’,2- azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS). El valor de la energía de activación (Ea) fue similar en ambas preparaciones cuando se utilizó como medio de reacción un amortiguador de fosfatos 50.0 mM a pH 6.0. La velocidad de inactivación térmica, ki , de la enzima siguió la ley de Arrhenius (ki =ki o exp –Ei/RT ). La enzima conjugada fue mucho más estable (ki y Ei , menores), que la nativa, cuando se ensayó en una solución de amortiguador y también resistió mejor el efecto desnaturalizante de los alcoholes de cadena corta (metanol, etanol y propanol). Dichas diferencias de estabilidad, siguen la secuencia: propanol>etanol>metanol. En los espectros de dicroísmo circular (CD) en la región UV-lejano, el comportamiento fue similar para MtL y MtL-PEG5000, siendo consistente con el de una proteína rica en estructura de hoja tipo β y con poco contenido de estructura α-hélice. Se presentó un ligero cambio del espectro DC en la región UV-cercano de la enzima conjugada respecto a la enzima nativa, que fue equiparable con la disminución de la polaridad de las cadenas laterales de los residuos de tirosina cuando se efectuó la conjugación. De forma similar, existió un desplazamiento del espectro del CuT1, de una λ ~ 610 nm para MtL hacia una λ ~ 575 nm para MtL-PEG5000. La calorimetría diferencial de barrido (CDB) muestra que las entalpías de desnaturalización son pequeñas (6.3 y 7.5 J g-1, para MtL y MtL-PEG5000, respectivamente), indicativo de una alta estabilidad de los plegamientos tipo hoja β en las lacasas. Sin embargo la enzima conjugada mostró una mayor estabilidad, ya que el valor de la temperatura media de desplegamiento, que fue 2 ºC mas alta que la de la enzima MtL. En alcoholes al 30%, la lacasa pegylada mostró una ligera disminución en la constante de inactivación ki , comparado con la enzima original. Este comportamiento fue causado por una disminución en la entropía de activación de la reacción de desnaturalización. Los resultados pueden ser explicados a través de una estabilización entrópica por el PEG debida a restricciones en la movilidad de las cadenas laterales de lo residuos de aminoácidos, lo que provoca un sitio activo más estable. this thesis we investigated the effect of the different solvents, such as methanol, ethanol and propanol, on the thermal stability on the enzyme laccase (EC 1.10.3.2), native and conjugated with poly (ethyleneglycol). The native laccase was extracted and purified from the dust Deni Lite IIs, commercialized by the company Novo Nordisk and produced through the heterologous expression of the gene of laccase from the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila (MtL) in Aspergillus oryzae (Berka et al., 1997). The enzyme that was conjugated through the covalent binding of chains of poly(ethylene glycol) (Mr = 5000) (mPEG5000) was labeled PEG5000-MtL. The native enzyme was found to have a molecular mass of 80 kDa, as determined by gel filtration, and 110 kDa, by SDS-PAGE. The oxidative dimerization of 2,6-dimethoxyphenol (DMP) to produce the corresponding dibenzoquinone was catalyzed by MtL in a manner comparable to that for a diffusion-controlled reaction (kcat/KM = 108 M-1 s-1 and Ea = 18 kJj M-1). PEG-MtL was found, by TNBS titration, to have blocked 54% of lysine groups; its hydrodynamic and charge properties were different from those of MtL. Catalytic efficiency (kcat/KM) of PEG5000-MtL was similar to that of MtL with DMP as substrate; however, kcat/KM was 2-fold reduced for the reaction in which 2’,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) is oxidized to form a radical cation. Ea values were similar in both enzyme preparations when assayed in buffered solutions. Far-UV CD spectra were similar for MtL and PEG-MtL and consistent with a protein rich in βsheet structure with negligible content of α-helices. A blue shift of near-UV CD spectrum for PEG5000-MtL as compared to MtL was consistent with the decreased polarity of the tyrosyl side chains upon PEG conjugation. Also the blue band of the copper active site was shifted from

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