Efecto antihiperglucémico de Tillandsia usneoides Linneo: posible participación de Flav1 sobre la translocación de GLUT2 y GLUT4 Público Deposited

La diabetes mellitus tipo 2 (DT2) es un trastorno metabólico crónico caracterizado por hiperglucemia sostenida asociada con resistencia a la insulina (RI) y ausencia en la producción de insulina. La RI afecta a diferentes órganos, incluyendo al músculo esquelético y al hígado, lo cual contribuye a las alteraciones del metabolismo de carbohidratos y lípidos características de la DT2. Los transportadores de glucosa (GLUT) son un grupo de proteínas transmembranales cuya función principal es transportar hexosas, incluida la glucosa. El GLUT2 desempeña un papel esencial en el transporte de glucosa en hígado. GLUT4 se encuentra principalmente en músculo esquelético y su translocación a la membrana depende de insulina. Aunque el hígado carece de una expresión significativa de GLUT4, algunos estudios revelan su importancia en las enfermedades metabólicas del hígado. El metabolismo de glucosa mediado por GLUT4 depende de la activación de la vía PI3K/Akt estimulada por la insulina, que regula también procesos proliferativos. La RI conduce a un aumento en la producción de glucosa en hígado y un desequilibrio en la captación y almacenamiento de glucosa en músculo esquelético. Alteraciones en GLUT2 y GLUT4 pueden conducir a condiciones fisiopatológicas relacionadas con la diabetes. Por lo tanto, la modulación de la activación de GLUT2 y GLUT4 podría considerarse un objetivo terapéutico para el control de la DT2. El manejo de la DT2 incluye cambios en el estilo de vida del individuo. El uso de agentes farmacológicos ha contribuido al control de la DT2; sin embargo, muchos fármacos generan efectos adversos indeseables. Esta situación ha llevado a continuar la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas para la diabetes. Las plantas medicinales representan una fuente importante de sustancias activas que pueden ayudar a controlar diferentes enfermedades, incluyendo la DT2. Tillandsia usneoides Linneo (T. usneoides) es una planta que se distribuye en México. Esta planta pertenece a la familia Bromeliaceae y es usada para tratar la diabetes mellitus (DM). Un estudio fitoquímico reveló la presencia del ácido 3- hidroxi-3-metilglutárico (HMG), entre otros compuestos, el cual mostró efecto hipoglucémico en ratones sanos. Sin embargo, el HMG también mostró efectos adversos. Por lo tanto, es posible que T. usneoides contenga otros compuestos que puedan explicar el efecto sobre la glucemia, sin presentar los efectos adversos observados con el HMG. En otros estudios, sobre la elucidación del mecanismo de acción hipoglucemiante del extracto acuoso de T. usneoides en células RINm5f, no se observó aumento en la concentración intracelular de Ca2+ ni en la secreción de insulina. Por lo tanto, esta acción sobre la glucemia puede involucrar un mecanismo extrapancreático asociado con la captación y almacenamiento de glucosa a nivel periférico. El extracto acuoso también incrementó la expresión de GLUT2 y disminuyó la actividad de GSK-3β en hepatocitos. Aunque se ha avanzado en el conocimiento de las acciones de T. usneoides sobre la glucemia, todavía es necesario explorar qué otros constituyentes podrían estar participando en esta acción y determinar su efecto sobre el transporte y almacenamiento de glucosa en células musculares y hepáticas. Objetivo Obtener un compuesto de T. usneoides con acción sobre la glucemia en ratones debido a la regulación de GLUT2 y GLUT4 en mioblastos C2C12 y hepatocitos primarios. Metodología El extracto acuoso y las fracciones (TU-AcOEt y TU-Acuosa) de T. usneoides se evaluaron en un bioensayo de actividad hipoglucémica y pruebas de tolerancia a la glucosa en ratones CD-1 sanos. La TU-AcOEt se fraccionó por cromatografía en columna y sus componentes químicos se detectaron por cromatografía en capa fina (CCF), obteniendo 5 fracciones (C1F1, C1F2, C1F3, C1F4 y C1F5) que se evaluaron en una prueba de tolerancia a la glucosa. La fracción activa (C1F3) se sometió también a pruebas de tolerancia al almidón y de inhibición de αglucosidasas in vitro. Después, C1F3 se fraccionó y las fracciones resultantes (C2F9-12, C2F22-25 y C2F38-44) se analizaron por HPLC, junto con C1F3. La fracción C2F38-44 también se analizó por espectrometría de masas (MS) y se sometió a un fraccionamiento adicional. La fracción C3F6-9 proveniente de C2F38- 44 se exploró por resonancia magnética nuclear (RMN), resultando en 5, 7, 4'- trihidroxi-3, 6, 3, 5'-tetrametoxiflavona (Flav1), cuyo contenido se cuantificó en la fracción TU-AcOEt por HPLC. El efecto citotóxico de las fracciones (C2F9-12, C2F22-25 y C2F38-44) y el compuesto Flav1 se evaluó mediante una prueba de rojo neutro a diferentes concentraciones, con baja y alta glucosa en mioblastos C2C12 y cultivo primario de hepatocitos. También, se realizó microscopía confocal para evaluar el efecto de las fracciones y Flav1 sobre la translocación de GLUT2 y GLUT4. Resultados El extracto acuoso y las fracciones de T. usneoides redujeron significativamente la glucosa en sangre. La fracción TU-AcOEt redujo los niveles de glucosa (17%) en la prueba de tolerancia a la glucosa, efecto similar al observado con la metformina; su fraccionamiento resultó en 5 fracciones, de las cuales C1F3 redujo la glucemia (19%) en la prueba de tolerancia a la glucosa, similar a metformina. También, C1F3 redujo la glucosa en sangre en la prueba de tolerancia al almidón y la actividad de α-glucosidasas in vitro. El fraccionamiento de C1F3 generó nuevas fracciones (C2F9-12, C2F22-25 y C2F38-44) que se analizaron por HPLC. La fracción mayoritaria (C2F38-44) fue explorada por MS y sometida a un nuevo fraccionamiento; el análisis por RMN de C3F6-9 reveló la presencia de Flav1. El tratamiento con Flav1 incrementó la translocación de GLUT4 en mioblastos C2C12 y hepatocitos primarios; en este cultivo de hepatocitos, la translocación de GLUT2 también se incrementó. Conclusiones T. usneoides es una planta antidiabética con efecto antihiperglucémico mediado, al menos en parte, por la translocación de GLUT2 y GLUT4 debido a Flav1. Estos datos apoyan la idea de que T. usneoides podría servir como fuente de materia prima para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos que ofrezcan una alternativa de tratamiento para la DT2.

Type 2 diabetes (T2D) is a chronic metabolic disorder characterized by sustained hyperglycemia associated with insulin resistance (IR) and the absence of insulin production. IR affects different organs, like skeletal muscle, and liver, which contributes to the imbalance in carbohydrate and lipid metabolism characteristic of T2D. The glucose transporters (GLUT) are a group of transmembrane proteins whose primary function is to transport hexoses, including glucose. GLUT2 plays an essential role in the transport of glucose in the liver. GLUT4 is mainly found in skeletal muscle, and its translocation to the membrane depends on insulin. Although the liver lacks a significant expression of GLUT4, some studies reveal its importance in metabolic diseases of the liver. Glucose metabolism mediated by GLUT4 depends on activating the PI3K/Akt pathway stimulated by insulin, which also regulates proliferative processes. IR increases liver glucose production, causing an imbalance in the uptake and storage of glucose in the skeletal muscle. Alterations in GLUT2 and GLUT4 can lead to pathophysiological conditions related to diabetes. Therefore, the modulation of the activation of GLUT2 and GLUT4 could be considered a therapeutic target for the control of T2D. The management of T2D includes changes in the individual´s lifestyle. The use of pharmacological agents has contributed to the control of T2D; however, many drugs generate undesirable adverse effects. This situation has led to continuing the search for new therapeutic alternatives for diabetes. Medicinal plants represent an important source of active substances that can help control different diseases, including T2D. Tillandsia usneoides Linneo (T. usneoides) is a plant that is distributed in Mexico. This plant belongs to the Bromeliaceae family and is used to treat diabetes mellitus (DM). A phytochemical study revealed the presence of the 3-hydroxy-3- methylglutaric acid (HMG), among other compounds, which showed a hypoglycemic effect in normal mice. However, HMG also exhibited adverse effects. Therefore, it is possible that T. usneoides contains other compounds that may explain the effect on the glycemia, without the adverse effects of the HMG. In other studies, about the elucidation of the hypoglycemic action mechanism of the aqueous extract of T. usneoides in RINm5f cells, there were no observed increase in the intracellular concentration of Ca2+ nor insulin secretion. Therefore, this action over glycemia may involve an extra-pancreatic mechanism associated with the intake and storage of glucose at the peripheral level. The aqueous extract increased the expression of GLUT2 and decreased the activity of GSK-3β in the primary culture of hepatocytes. Although the knowledge of the actions on the glycemia of T. usneoides has increased, it is yet necessary to explore what other constituents might be participating in this action and determine its effect on the transport and storage of glucose in muscle and liver cells. Objective To obtain a compound of T. usneoides with action on glycemia in mice due to the regulation of GLUT2 and GLUT4 in myoblasts and primary hepatocytes. Methodology The aqueous extract and the fractions (TU-AcOEt and TU-Aqueous) of T. usneoides were evaluated in a bioassay for hypoglycemic activity and glucose tolerance tests in healthy CD-1 mice. TU-AcOEt was fractionated by column chromatography, and its chemical components were detected by thin-layer chromatography (TLC), obtaining 5 fractions (C1F1, C1F2, C1F3, C1F4, and C1F5) that were evaluated in a glucose tolerance test. The active fraction (C1F3) was also tested for starch tolerance and inhibition of α-glucosidases in vitro. Then, C1F3 was fractionated, and the resulting fractions (C2F9-12, C2F22-25, and C2F38-44) were analyzed by HPLC, along with C1F3. The C2F38-44 fraction was also analyzed by mass spectrometry (MS) and subjected to further fractionation. The C3F6-9 fraction from C2F38-44 was explored by nuclear magnetic resonance (NMR), resulting in 5, 7, 4'- trihydroxy-3, 6, 3, 5'-tetramethoxyflavone (Flav1), whose content was quantified in the TU-AcOEt fraction by HPLC. The cytotoxic effect of the fractions (C2F9-12, C2F22-25, and C2F38-44) and the Flav1 compound was evaluated by a neutral red test at different concentrations, with low and high glucose in C2C12 myoblasts and primary culture of hepatocytes. Also, confocal microscopy was performed to evaluate the effect of fractions and Flav1 on the translocation of GLUT2 and GLUT4. Results The aqueous extract and the T. usneoides fractions significantly reduced blood glucose. The TU-AcOEt fraction reduced glucose levels (17%) in the glucose tolerance test, an effect like that seen with metformin; its fractionation resulted in 5 fractions, where C1F3 reduced glycemia (19%) in the glucose tolerance test, like metformin. Also, C1F3 reduced blood glucose in the starch tolerance test and αglucosidase activity in vitro. The fractionation of C1F3 generated new fractions (C2F9-12, C2F22-25, and C2F38-44) analyzed by HPLC. The majority fraction (C2F38-44) was explored by MS and subjected to a new fractionation; the NMR analysis of C3F6-9 revealed the presence of Flav1. Treatment with Flav1 increased GLUT4 translocation in C2C12 myoblasts and primary hepatocytes; in this hepatocytes culture, GLUT2 translocation was also increased. Conclusions T. usneoides is an antidiabetic plant with antihyperglycemic effect mediated, at least in part, by GLUT2 and GLUT4 translocation due to Flav1. These data support the idea that T. usneoides could serve as a source of raw material for developing new therapeutic agents that offer an alternative treatment for T2D.

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