Expresión del gen de la acetilcolinesterasa en linfocitos B y en células leucémicas Público Deposited
INTRODUCCIÓN La acetilcolinesterasa (AChE) es una proteína con actividad enzimática, cuya función en los órganos colinérgicos es la de hidrolizar al neurotransmisor acetilcolina (ACh), permitiendo un control preciso de la sinapsis colinérgica. La expresión del gen de la AChE da como resultado diversas formas moleculares de la proteína, como consecuencia de un proceso de corte y empalme alternativo de un mRNA primario, generándose tres mRNA (mRNA-R, mRNA-H y mRNA-T). La AChE a parte de la función colinérgica, realiza otras funciones alternativas, como participar en procesos de adhesión celular, diferenciación celular, eliminación de algunas drogas, como su participación en el proceso de apoptosis celular. Recientemente se ha estudiado a la AChE en algunas patologías como diabetes, síndrome metabólico, y en distintos tipos de cáncer. En este trabajo nos enfocamos al estudio de la AChE en la leucemia linfoblástica aguda pre B (LLA pre-B), debido a que en varias leucemias se ha reportado variaciones en los mRNA de la AChE, así como modificaciones en su actividad enzimática. METODOLOGÍA A partir de muestras de sangre de niños controles (n =100), médula ósea de niños diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda pre-B (n=3) y línea celular REH pre-B (n=3 cultivos) proporcionados por el Instituto Nacional de Pediatría, se purificaron linfocitos B por el método de separación magnética MACS. Se realizó la extracción de mRNA por el método del Trizol. Para la identificación de los mRNA AChE se llevó a cabo la amplificación por RT-PCR de dos pasos. La extracción de la AchE y proteínas totales se logró por un método secuencial sin (S1) o con Triton X-100 (S2). La actividad AChE se estimó por el Ellman y el contenido total de proteína por el método de Bradford. Para establecer el carácter anfifílico de las formas enzimáticas en los diferentes tipos celulares, se realizó la mezcla de las fracciones S1 y S2 y se sometieron a cromtagrafía hidrofóbica en una matriz de octil-efarosa. Para analizar el procesamiento post-traduccional, los extractos de proteínasS1+S2 se pusieron a interaccionar con lectinas que reconocen a carbohidratos específicos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el análisis de actividad AChE se observó un aumento en las células de médula ósea de la leucemia linfoblástica aguda pre-B, y una disminución en la línea celular REH pre-B al compararlos con los valores de actividad AChE extraídad de los linfocitos B controles. La actividad AChE estimada estuvo sustentada en la expresión de variantes de mRNA AChE. En el análisis de la expresión de los mensajeros de la AChE, en los linfocitos B controles, las células de médula ósea de leucemia linfoblástica aguda pre-B y las células REH pre-B se detectaron los productos de amplificación que correspondieron a las variantes AChE-H y AChER, evidenciando que no hubo variaciones en el proceso de corte y empalme de exones. Hecho que parece sustentarse en el análisis del carácter anfifílico de las formas enzimáticas AChE, donde se observaron dos picos: formas no retenidas (hidrofílicas) que podrían corresponder a monómeros hidrofílicos y formas retenidas, que podrían corresponder a dímeros anfifílicos. El estudio del procesamiento post-traduccional mostró diferencias en los patrones de glicosilación en las células de la médula ósea de leucemia linfoblástica aguda y la línea celular REH pre-B en relación al patrón observado en los linfocitos B controles, evidenciando un proceso de glicosilación anómalo. Estas modificacione podrían estar relacionadas con las diferencias observadas en la actividad enzimática AChE. CONCLUSIONES La actividad AChE en las células de la leucemia linfoblástica aguda pre-B se observó alterada en relación a las células B controles. En la médula ósea se observó un aumento, mientras que, en la línea celular Pre-B se observó una disminución. La actividad dependió de formas moleculares hidrofílicas (no retenidas, AChE-R) y anfifílicas (retenidas, AChE-H) según se desprendió del análisis del carácter anfifiñilico. El análisis de expresión de las variantes de mRNAAChE, mostró productos de amplificación que parecen corresponder a las variantes: AChE-H, y AChE-R, que codifican para dímeros anfifílicos anclados por enlace glicofosfatidilinositol y monómeros hidrofílicos, respectivamente. Finalmente, el proceso de glicosilación fue anómalo en las células leucemicas, como se mostró en el análisis de incorporación de carbohidratos.
INTRODUCTION Acetylcholinesterase (AChE) is a protein with enzymatic activity, which in organs cholinergic function is to hydrolyse the neurotransmitter acetylcholine (ACh), allowing precise control of cholinergic synapses. The expression of AChE gene results in various molecular forms of the protein as a consequence of a process of alternative splicing of a primary mRNA, generating three mRNA (AChE-T, AChE-H. AChE-R). AChE besides cholinergic function performs other alternative activities, such as participating in processes of cell adhesion, cell differentiation, elimination of some drugs, such as their participation in the process of apoptosis. It has recently been studied in some pathologies AChE as diabetes, metabolic syndrome, and cancers. In leukemia has been reported alterations on AChE mRNA, as well as activity AChE. In this study we focused the study of AChE in the pre-B acute lymphoblastic leukemia (pre-B). METHODOLOGY From blood samples from control children (n = 100), bone marrow of children diagnosed with acute lymphoblastic leukemia pre-B (n = 3) and cell line REH pre-B (n = 3 cultures) provided by the National Institute of Pediatrics, purified lymphocytes B by MACS magnetic separation method. Was performed by extracting mRNA by Trizol method. To identify the AChE mRNA was carried out by RT-PCR amplification of two steps. The extraction of AChE and total protein was achieved by a sequential method without (S1) or with Triton X-100 (S2). The AChE activity was estimated by Ellman et al and the total protein content by the Bradford method. To establish the amphiphilic character of the enzyme forms in the different cellular types was performed fractions mixture S1 and S2 and subjected to a hydrophobic chromatograpy on octyl-sepharose matrix. To analyze post- translational processing, the extracts S1 + S2 were put to interact with lectins that recognize specific carbohydrates. RESULTS AND DISCUSSION In the analysis of AChE activity increase was observed in bone marrow cells of acute lymphoblastic leukemia pre-B, and a decrease in the REH cell line pre-B when were compared with the values of AChE activity from B lymphocytes controls. Estimated AChE activity is sustained on expression of AChE mRNA variants. Analysis of the expression of AChE messengers, controls in B lymphocytes, bone marrow cells of acute lymphoblastic leukemia pre-B cells and pre-B REH were detected amplification products that correspond to variants AChE -H and AChE-R, showing that there was no change in process splicing of mRNA. Done that seems supported by the amphiphilic character analysis of AChE enzyme forms where two peaks were observed: forms not retained that could correspond to hydrophilic monomers and retained forms, which could correspond to amphiphilic dimers. Differences were observed on glycosylation patterns in bone marrow cells of acute lymphoblastic leukemia cell line REH pre-B in relation to the pattern observed in control B cells, showing a glycosylation process anomalous. These modificacione could be related to the observed differences in AChE enzyme activity. CONCLUSIONS The AChE activity eas observed in leukemia cells pre-B acute lymphoblastic altered respect to control B cells. In bone marrow showed an increase, while in the pre-B cell line showed a decrease. The activity depended hydrophilic molecular forms (not retained, AChE-R) and amphiphilic (retained AChE-H) as inferred amphyphilic character analysis. The analysis of expression of the mRNA-AChE variants showed amplification products that appear to correspond to variants: AChE-H, and AChE-R encoding amphiphilic dimers and anchored by hydrophilic monomers glycophosphatidylinositol link, respectively. Finally, the glycosylation process was abnormal in leukemia cells, as shown in the incorporation of carbohydrate analysis.
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