%0 Tesiuam %T Clonación y sobreexpresión del gen regulador global laeA en Aspergillus terreus TUB-514: efecto sobre la producción de lovastatina en fermentación sólida y líquida %A Pérez Aguirre, Teresa %D 2009-09-25 %8 2022-05-25 %E Fierro Fierro, Francisco; Gómez Quiroz, Luis Enrique; Barrios González, Javier; Fernández Perrino, Francisco José; Mejía Álvarez, Armando %I Universidad Autónoma Metropolitana %R https://doi.org/10.24275/uami.h415p965q %X Las bacterias del grupo actinomicetos y hongos filamentosos son los principales productores de metabolitos secundarios. Aspergillus terreus es un hongo filamentoso que produce lovastatina, metabolito secundario que tiene actividad farmacológica muy importante, ya que reduce los niveles de colesterol y triglicéridos en sangre. En forma convencional, la producción de lovastatina se ha llevado a cabo en medio líquido, sin embargo, nuestro grupo de investigación ha desarrollado un sistema novedoso en fermentación sólida (FS) utilizando un soporte inerte artificial donde la producción de lovastatina se eleva considerablemente. Para hacer más productivo el sistema, es necesario desarrollar metodología para mejorar genéticamente las cepas, particularmente para FS. Una opción sofisticada es la amplificación del gen regulador global positivo de metabolitos secundarios, llamado laeA, éste codifica una proteína con posible actividad metiltransferasa, y regula la transcripción de genes biosintéticos de metabolitos secundarios probablemente mediante la modificación de la cromatina, quizás por intervención con metilasas o diacetilasas. El objetivo principal en este trabajo fue evaluar la sobreexpresión del gen laeA (SE::laeA) en A. terreus como estrategia para incrementar la producción de lovastatina, sin embargo, considerando que para lograrlo se llevaron a cabo 2 estrategias, sobreexpresar el gen laeA a partir de su propio promotor y mediante un promotor constitutivo (gpdA), es posible que el efecto sea diferente en fermentación sólida (FS) y fermentación líquida (FL). Se amplificaron dos fragmentos con el gen laeA (completo y secuencia codificadora) y se clonaron en los vectores plasmídicos (pULC43 y pAN52.1), obteniéndose 2 construcciones: pUAMTPlaeA (propio promotor del gen laeA) y pUAMTPlaeAcons (promotor gpdA). Se transformaron dichas construcciones en A. terreus, y con las 13 transformantes confirmadas de pUAMTPlaeA, se realizó una preselección mediante la producción de lovastatina en fermentación en cilindro de agar (FCA). Se preseleccionaron 7 transformantes que mostraron producciones superiores a la parental en FCA y se evaluó su producción de lovastatina al séptimo día en FS y FL. En FS, todas las transformantes pUAMTPlaeA exhibieron niveles de producción superior a la parental; con incrementos desde 5% hasta 47.4%. Es de destacar que sólo 4 de estas transformantes presentaron incrementos en la producción de lovastatina en FL, obteniéndose fuertes disminuciones en las otras 3. El rango de variación en FL fue de -54.8% a 89.2%. En cuanto a las transformantes con promotor constitutivo (pUAMTPlaeAcos), sólo se obtuvieron 5 transformantes confirmadas, por lo que no se preseleccionaron, sino que todas se evaluaron en FS y FL. En este caso también, todas las transformantes fueron sobreproductoras en FS con incrementos desde 29.7% hasta 137.9%. En FL sólo 3 fueron sobreproductoras y 2 mostraron fuertes disminuciones; con rango de variación de -34.3% a 100.8%. Con base en estos datos se seleccionaron las transformantes pUAMTPlaeA T12, T13 y T14 y se evaluó su producción en forma más precisa, realizando cinéticas de producción y haciendo un análisis estadístico. Así, las mejores productoras de lovastatina de este grupo, en FS, fueron T12 y T13, con producciones de 10.49 y 11.87 mg /gms respectivamente; lo cual representa incrementos de 49.26 y 68.78% con respecto a la producción de la parental. En FL la mejor productora de este grupo (y de todas) fue T14, con una producción de 1.39 mg/mL, y un incremento de 111% respecto a la parental (p<0.00001). De igual forma se hicieron cinéticas de las 2 transformantes seleccionadas que expresaron laeA desde un promotor constitutivo (pUAMTPlaeAcons). La mejor productora de este grupo (y de todas) en FS, fue T2, con una producción de 16.8 mg/gms, representando un incremento de 138.64% (p<0.00001). La mejor productora en FL fue T5, con una producción de 1.3 mg/mL y un 94.5% de incremento. La prueba de Tukey demostró que las diferencias fueron significativas (p < 0.05). Estos resultados indican que el incremento de la dosis génica de laeA en A. terreus es un método eficiente de mejoramiento genético molecular de la producción de lovastatina en FS y también en FL, aunque las mejores transformantes no son las mismas para uno u otro sistema. Probablemente es más conveniente sobreexpresar laeA desde un promotor constitutivo para aislar cepas específicas para FS, mientras que para FL sería probablemente más conveniente laeA expresado desde su propio promotor para generar cepas sobreproductoras. Un punto interesante es que la mejor transformante para FS mostró una disminución (10.9%) en su producción en FL, confirmando que las características para producir altos niveles de lovastatina en FS son diferentes a las necesarias para producirlos en FL. Algunos resultados sugieren que la producción en FL es más susceptible a problemas derivados del punto de inserción del gen laeA, pues una proporción importante de transformantes redujo su producción en FL (40%), mientras que todas incrementaron su producción en FS. Por otra parte, las transformantes obtenidas mostraron cambios en su morfología colonial, observándose surcos y más esporulacion con respecto a la parental, lo que da evidencia de que la morfología de las transformantes fue afectada por la sobreexpresión de laeA. %G spa %[ 2023-11-29 %9 info:eu-repo/semantics/masterThesis %~ UAM %W UAM