Respuesta inflamatoria a estímulos bacterianos por células mononucleares periféricas de pacientes cirróticos - Barbero Becerra, Varenka Julieta (Universidad Autónoma Metropolitana, 2006)
Increased plasma endotoxin levels in cirrhotic patients have been attributed to intestinal bacterial translocation and decreased liver clearance. In the presence of liver injury, endotoxin is able to induce inflammation, promoting further injury, and eventually, cirrhosis. Toll-like receptors (TLRs) participate in the recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), and the subsequent activation of pro- and anti-inflammatory mediators. Among them, TLR2 recognize lipoteichoic acid (LTA) of gram-positive bacteria, and TLR4 recognize lipopolisaccharyde (LPS) or endotoxin of gram-negative bacteria. Activation of TLR4 by gramnegative bacteria is able to trigger inflammatory response and liver injury. The sole activation of TLR2, however, does not appear to be sufficient to produce inflammation. This study evaluates the inflammatory response of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from cirrhotic and non-cirrhotic patients to products of both gram-positive and negative bacteria, in terms of cytokine secretion (TNFα, IL1β, IL-6, IL-12 and IL-10), and TLR2 and TLR4 expression before and after exposure to LPS or LTA. It also explores the correlation of these mediators with plasma LPS and LPS-binding protein (LBP). PBMC obtained from six child A-B cirrhotic patients and six non-cirrhotic controls were exposed to LPS or LTA. Preand post-exposure cytokine secretion was measured by means of ELISA, receptor expression was assessed by flow cytometry using monoclonal antibodies, and plasma LPS and LBP levels were determined using the Limulus assay and ELISA, respectively. Data are summarized as median values and analyzed by Wilcoxon tests, correlations are expressed as Spearman correlation indexes. Plasma LPS and LBP levels were higher in cirrhotic patients. TNFα, IL-6 and IL-12 plasma levels were higher in cirrhotic patients too, with the exception of IL-10 which was lower, whereas IL-1β levels were not detectable. Differences did not reach statistical significance. Ex-vivo expression of TLR2, TLR4 and CD14 in PBMC was higher in cirrhotic patients (P< 0.02). In-vitro assays of PBMC exposure to LPS triggered a more vigorous cytokine secretion than the exposure to LTA in both groups. PBMC showed a decrease in TLR2 and TLR4 in-vitro expression after exposure to LPS in both groups, whereas LTA exposure was followed by an increase in TLR2 expression in non-cirrhotic control group only. LPS and LBP levels correlated inversely and significantly in non-cirrhotic control group only. Plasma LPS and LBP levels were not correlated with PBMC cytokine secretion and TLR expression before or after exposure to LPS or LTA. In conclusion, inflammatory cytokine secretion by PBMC increases after LPS or LTA exposure. This increase is larger with LPS. LPS and LTA exposure is followed by a decrease in both TLR2 and TLR4 expression. These results suggest that products of gramnegative bacteria activate both TLRs pathways, and can have an additive effect. Molecular studies of host immune activation and regulation will lead to a better understanding of the chronic liver inflammation process.; Concentraciones elevadas de endotoxina plasmática en pacientes cirróticos se han atribuido a una translocación bacteriana intestinal y a una disminución de la depuración hepática. En presencia de daño hepático, las endotoxinas son capaces de inducir inflamación, promoviendo la perpetuación de daño, eventualmente cirrosis. Los receptores tipo toll (TLRs) participan en el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), y en la activación subsiguiente de mediadores pro- y anti-inflamatorios. De los cuales, el TLR2 reconoce al ácido lipoteicóico (LTA) de bacterias gram-positivas, y el TLR4 reconoce al lipopolisacárido (LPS) o endotoxina de bacterias gram-negativas. La activación del TLR4 por bacterias gram-negativas es capaz de disparar una respuesta inflamatoria y daño hepático. La activación solo del TLR2, parece no ser suficiente para producir inflamación. Este estudio evaluó la respuesta inflamatoria de células mononucleares periféricas (PBMC) de pacientes cirróticos y no-cirróticos a productos de bacterias gram-positivas y gram-negativas, mediante la secreción de citocinas (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-12 e IL-10), y la expresión de TLR2 y TLR4 antes y después de la exposición a LPS o LTA. Así mismo, se determinó la correlación de estos mediadores con concentraciones plasmáticas de LPS y la proteína unidora de LPS (LBP). PBMC aisladas de seis pacientes cirróticos estadio child A-B y seis pacientes control se expusieron a LPS o LTA. La secreción de citocinas pre- y post-exposición fue determinada por ELISA, la expresión de los receptores se determinó por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales, y las concentraciones plasmáticas de LPS y LBP se determinaron utilizando el ensayo de Limulus y ELISA, respectivamente. Los datos se presentaron como medianas y se analizaron por la prueba de Wilcoxon, las correlaciones se expresaron como índices de correlación de Spearman. Las concentraciones plasmáticas de LPS y LBP fueron mayores en pacientes cirróticos, así como concentraciones de TNFα, IL-6 e IL-12, con la excepción de IL-10, la cual fue menor en este grupo, mientras que la IL-1β no presentó concentraciones detectables. Las diferencias no presentaron significancia estadística. La expresión ex-vivo de TL2, TLR4 y CD14 en PBMC fue mayor en pacientes cirróticos (P< 0.02). Ensayos In-vitro de PBMC expuestas a LPS disparan una secreción más vigorosa de citocinas que la exposición a LTA, en ambos grupos. Las PBMC mostraron una expresión in-vitro menor de TLR2 y TLR4 con la exposición a LPS en ambos grupos, mientras con el LTA, solamente se observó un aumento en la expresión de TLR2 en pacientes control. Las concentraciones plasmáticas de LPS y LBP correlacionaron significativa- e inversamente en pacientes control solamente, no así con la secreción de citocinas y expresión de los TLRs antes o después de la exposición a LPS o LTA. A manera de conclusión, la secreción de citocinas inflamatorias por las PBMC aumenta después de la exposición a LPS o LTA. Este aumento es mayor con LPS. La exposición a LPS y a LTA es seguida por una disminución en la expresión de TLR2 y TLR4. Estos resultados sugieren que productos de bacterias gram-negativas activan ambas vías de TLRs, pudiendo presentar efectos aditivos. Estudios moleculares de activación y regulación del hospedero nos guiarán a un mejor entendimiento de los procesos involucrados en la inflamación crónica hepática.