Biotransformación de ácidos hidroxicinámicos por hongos del género Aspergillus Público Deposited

En este estudio se biotransformaron ácidos hidroxicinámicos presentes en un subproducto agrícola mexicano como lo es la pulpa de café. Para llevar a cabo este estudio, se usaron mohos de la colección fúngica de la Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa (UAMI) y de el Institut de Recherche pour le Développement (IRD). Estas cepas fueron aisladas de las zonas cafetaleras de Veracruz y Chiapas (Roussos et al., 1989). Para el desarrollo de este trabajo, se tomó como vía de referencia la vía del ácido fenilpropenóico que es una vía del metabolismo secundario (Verpoorte, 2000). Se encontró que las cepas aisladas del nicho biológico del café presentaron capacidad para biotransformar los ácidos hidroxicinámicos. De las19 cepas estudiadas, sólo 8 cepas mostraron actividad, 7 del género Aspergillus y 1 del género Penicillium. Ninguna de estas 8 cepas, silvestre o modificadas mostraron la capacidad de biodegradar todos los sustratos con respecto a la vía de referencia hasta vainillina. Las cepas de hongos filamentosos utilizadas mostraron diferentes capacidades enzimáticas para biotransformar ácidos hidroxicinámicos en los intermediarios de esta vía, además que se obtuvieron otras moléculas interesantes (como el 4-vinilguayacol). Se comparó la biotransformación en cultivo líquido y sólido con el ácido p- cumárico y ferúlico. Se encontró que el cultivo sólido mostró ser una herramienta interesante en el proceso de biotransformación del ácido ferúlico ya que en la producción del 4-vinilguayacol la producción fue de casi el doble al comparar con el cultivo líquido. Con el cultivo sólido, también se observó una generación de productos diferente, en el caso de la biotransformación del ácido ferúlico y p-cumárico. Los estudios enzimáticos de la enzima ferúlico descarboxilasa del extracto de A. niger DAR 2, mostraron que la enzima es intracelular con un pH y temperatura óptima de 6 y 40ºC, respectivamente y que posiblemente es una enzima con un peso molecular aproximado de 91kDA. Este último dato deberá confirmarse posteriormente. En el caso de la biotransformación del ácido clorogénico en cultivo líquido, se encontró que A. niger C23308 produjo 400 mg/l de ácido caféico y 24 mg/l de ácido protocatecóico a las 36 h de biotransformación. Ambos productos reconocidos por su capacidad antioxidante. Por lo que podría ser aplicado en la pulpa de café, ya que la concentración del ácido clorogénico en este subproducto es de 3097 mg/kg. La biotransformación del ácido p-cumárico en cultivo líquido por A. tamarii V12307 con medio de cultivo A (altas concentraciones de azúcares), muestra que posiblemente el mecanismo de reacción es por medio de la degradación de la cadena propenóica para la formación del ácido p-hidroxibenzóico. A. tamarii mostró una productividad de 5 mg/l h de ácido p-hidroxibenzóico de 2.5 veces mayor, comparada a la de P. variotii de 2 mg/l h (Sachan et al., 2006) La misma cepa A. tamarii en cultivo líquido y medio de cultivo B (bajas concentraciones de azúcar), muestra la capacidad de generar el ácido caféico como se establece en la vía de referencia. Esta reacción de biotransformación sugiere la presencia de la enzima 4-cumarato-3-hidroxilasa en el microorganismo. La productividad alcanzada con esta cepa fue de 144 mg/ l d, 9 veces mayor que la obtenida con P. cinnabarinus de 16 mg/ l d (Estrada- Alvarado et al., 2003). En cultivo sólido, A. tamarii V12307, biotransforma el ácido p-cumárico con rendimientos de 56% y 24%, con medio de cultivo A y B. en diversos compuestos, con medio A, sólo se produce un compuesto. Los productos obtenidos por cultivo sólido deberán ser identificados posteriormente. A. niger C17309 en cultivo líquido biotransforma el ácido p-cumárico en intermediarios del hidroxibenzoato, generando compuestos de alto valor agregado como el 4-hidroxibenzaldehído, el metil-4- hidroxibenzoato, la hidroquinona y el 4-propilfenolen en una proporción de 2.47%, 0.54%, 10.6%, 0.65%, respectivamente. La presencia de estos compuestos sugiere que las reacciones se dan a nivel de la cadena propenóica y no en el anillo aromático. El ácido ferúlico en cultivo líquido es biotransformado por A. niger C28B25 por la vía de la degradación de la cadena propenóica en ácido vainillínico. Además, se observó una productividad en términos de mg/ l d de 3 veces mayor con A. niger C28B25 que la reportada con P. variotii MTCC 6581 (Ghosh et al., 2006) La biotransformación del ácido ferúlico en 4-vinilguayacol por A. niger DAR 2, se efectúa preferencialmente por la descarboxilación no oxidativa. El cultivo sólido mostró ser una herramienta interesante en el proceso de biotransformación del ácido ferúlico en 4-vinilguayacol que tiene un valor de 40 veces mayor que el ácido ferúlico y que es ampliamente utilizado en la industria alimentaria y farmacéutica. En cultivo sólido la producción fue de casi el doble de 4 vinilguayacol que en cultivo líquido en una tercera parte del tiempo, también se observó una generación de productos diferente, ya que la cepa silvestre C28B25 en cultivo sólido biodegradó el ácido ferúlico en ácido caféico, mientras que en cultivo líquido no se observó este producto. Un exceso de azúcares en el medio de cultivo puede inhibir de alguna manera la generación de productos y no sólo la presencia de azúcares de fácil asimilación, como ya estaba reportado (Ander et al., 1980; Lesage Meesen et al., 1997).) En la vía de biotransformación del ácido ferúlico en cultivo sólido y líquido se presentan reacciones principalmente a nivel de la cadena propenóica, a excepción del cultivo sólido con la cepa silvestre C28B25, donde se observo una desmetilación del anillo. El estudio de la purificación de la enzima ferúlico descarboxilasa a partir del extracto de A. niger DAR 2, mostró que la enzima es intracelular con un pH y temperatura óptima de 6 y 40ºC, respectivamente y que posiblemente es una enzima con un peso molecular aproximado de 91kDA. Este último dato deberá confirmarse posteriormente. Los sistemas de biotransformación estudiados, podrían ser aplicados a la pulpa de café y también a otros subproductos agroindustriales con cantidades interesantes de ácidos hidroxicinámicos, para la obtención de antioxidantes y precursores de aromas naturales por haber sido obtenidos mediante procesos de biotransformación.

In this study hydroxycinnamic acids were biotransformed. These acids are present in mexican agricultural by-products such as coffee pulp. In order to fulfill this study, moulds from the Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa (UAMI) and from the Institut de Recherche pour le Développement (IRD) were used. These strains were isolated from Veracruz and Chiapas coffee plantations (Roussos et al., 1989). For the development of this work, phenylpropenoic acid pathway was taken as a reference, which is a pathway from the secondary metabolism (Verpoorte, 2000). It was found that isolated strains from coffee biological niche presented a capacity to biotransform hydroxycinnamic acids. From the 19 strains studied, only 8 strains showed activity, 7 Aspergillus strains and 1 Penicillium. None of these 8 strains, wild or modified showed the capacity to biodegrade all substrates with respect to the reference pathway all the way through vanillin. Strains from filamentous fungi used showed different enzymatic capacities to biotransform hydroxycinnamic acids in the intermediaries from this pathway, besides, other interesting molecules were obtained (such as 4–vinylguaiacol). Biotransformation in liquid and solid culture with p-coumaric and ferulic acid was compared. It was found that solid culture is an interesting tool. In ferulic acid biotransformation process since 4–vinylguaiacol production was almost twice as much when comparing it with the liquid culture. With the solid culture, it was observed as well different products generation, in the case of p-coumaric and ferulic acid biotransformation. Enzymatic studies from ferulic descarboxylase enzyme from A. niger DAR 2 extract, showed that the enzyme is intracellular with a pH and temperature optimal of 6 and 40 ºC respectively and that possibly, it is an enzyme with an approximate molecular weight of 91kDA. This latter value must be confirmed in the future. In the case of chlorogenic acid biotransformation in liquid culture, it was found that A. niger C23308 produced 400 mg/l from caffeic acid and 24 mg/l from protocatechuic acid at 36 hours of biotransformation. Both products are well known for their antioxidant capacity. This could be applied in coffee pulp, since chlorogenic acids concentration in this by-product is around 3097 mg/kg. The p-coumaric acid biotransformation in liquid culture by A. tamarii V12307 with culture medium A (high sugar concentrations), shows that the mechanism reaction is possibly made by means of propenoic chain degradation for p- hydroxybenzoic acid formation. A. tamarii showed a productivity of 5 mg/l h from p-hydroxybenzoic acid, 2.5 times greater, compared with P. variotii of 2 mg/l h (Sachan et al., 2006). The same strain A. tamarii in liquid culture and culture medium B (low sugar concentrations) and p- coumaric acid, shows the capacity to generate caffeic acid as stablished in the pathway reference. This biotransformation reaction suggests the presence of 4-coumarate-3- hydroxilase enzyme in the microorganism. The productivity yielded with this strain was of 144 mg/ l d, 9 times greater than the one obtained with P. cinnabarinus of 16 mg/ l d (Estrada- Alvarado et al., 2003). In solid culture, A. tamarii V12307, biotransform p-coumaric acid with yields of 56% and 24%, with medium A and B. In medium A with different compounds, only one compound is produced. Products obtained by solid culture shall be identified lately. A. niger C17309 in liquid culture biotransforms p-coumaric acid in intermediaries from hydroxybenzoate, generating compounds of high added value such as 4–hydroxybenzaldehyde, methyl-hydroxybenzoate, hydroquinone and 4–propylphenol in a proportion of 2.47%, 0.54%, 10.6%, 0.65%, respectively. The presence of these compounds suggests that reactions are given at the propenoic chain level and not in the aromatic ring. Ferulic acid in liquid culture is biotransformed by A. niger C28B25 by the degradation pathway from the propenoic chain in vanillic acid. Furthermore, it was observed a productivity in terms of mg/ l d of 3 times greater with A. niger C28B25 than the one reported with P. variotii MTCC 6581 (Ghosh et al., 2006). Ferulic acid biotransformation into 4–vinylguaiacol by A. niger DAR 2, is done mostly by non oxidative decarboxilation. When this compound was obtained in solid culture, productivity was two times, besides, the time was shorter, in a third part than in liquid culture. With the same system, wild strain A. niger C28B25 transform ferulic acid into caffeic acid while in liquid cultures this compound it was not found. Ferulic acid biotransformation showed principally reactions in propenoic chain, with exception of wild strain C28B25 using solid culture, in this case, the reaction was demetylation of aromatic ring. In this work, it was showed that high sugar concentrations could inhibit the products generation, and not only the easiest sugars assimilation as Ander et al., (1980), and Lesage Meesen et al., (1997) reported. The biotransformation reactions studied in this work, could be applied in coffee pulp and in another byproducts with an interesting hydroxycinnamic acids level, in order to obtained natural antioxidants and flavours.

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