Caracterización de comunidades microbianas asociadas a cerezas frescas y secas de café de la región de Tabasco mediante métodos dependientes e independientes del cultivo - Gutiérrez Rodríguez, Elisa Karen (Universidad Autónoma Metropolitana, 2019)
In coffee processing, a large number of microorganisms that can have an effect on the quality of the product are naturally present. Studies focused on shaping microbial communities, however, are scarce, and only a few use cultureindependent methods. In this study, the isolation and molecular identification (16S rRNA and ITS region sequence analysis) of bacteria and filamentous fungi, from fresh and dried coffee cherries from Tabasco (Tacotalpa), was carried out; potential ochratoxin A (OTA) producers’ occurrence was evaluated, and the toxin production was determined by HPLC. Complementary to this, the metabarcoding technique (16S rDNA V3–V4 region and ITS2 region sequencing on an Illumina MiSeq™ platform) was employed as a culture-independent method to analyze the cherries bacterial and fungal communities. With the bacteria isolation, the abundance of Gram-negative bacteria was observed, among which, the genus Klebsiella and the species Pantoea agglomerans were identified. Among the isolated fungi, the presence of different genera and species, that in some cases were not detected by metabarcoding, was determined and in particular, it was observed, only in dried cherries, the contamination with Aspergillus niger, for which the OTA production (105.03 ± 16.36 μg / kg of medium) was demonstrated by HPLC. On the other hand, with metabarcoding, some coincidences were observed such as the presence of Klebsiella and P. agglomerans, among the bacteria represented with greater abundance, and the contamination with A. niger in dried cherries. This technique, however, allowed a deeper analysis of the microbial diversity and to evidence the difference in fresh and dried cherries populations. Among the bacterial operational taxonomic units (OTUs), Proteobacteria and Firmicutes were the dominant phyla, with the Firmicutes in a higher proportion in dried cherries than in fresh ones due to the presence of the genus Weissella. Among the fungal OTUs, Ascomycota and Basidiomycota were the dominant phyla, with a higher proportion of Basidiomycota in fresh cherries than in dried cherries, in which a higher proportion of the genus Aspergillus was also observed. Additionally, yeasts abundance was determined at the two processing points, and many genera and species of bacteria and filamentous fungi that were not found by isolation were detected, demonstrating once again the importance of using culture-dependent and culture-independent methods in conjunction to perform a better characterization of the microbial communities present in coffee cherries and their processing.; En el procesamiento del café se encuentran presentes un gran número de microorganismos que pueden tener un efecto en la calidad del producto. Los estudios enfocados a identificar las comunidades microbianas, sin embargo, son escasos, y de estos, pocos usan métodos independientes del cultivo. En este trabajo se llevó a cabo, a partir de cerezas frescas y secas de café de Tabasco (municipio Tacotalpa), el aislamiento de bacterias (en condiciones de anaerobiosis) y hongos filamentosos, seguido de su identificación molecular por análisis de secuencias de ADNr 16S y de la región ITS. Entre el grupo de hongos filamentosos se evaluó además la incidencia de los posibles productores de ocratoxina A (OTA) y se determinó la producción de la misma por HPLC. Complementario a ello se empleó la técnica de metabarcoding (secuenciación de la región V3-V4 del ADNr 16S y de la región ITS2 en la plataforma Miseq™ de Illumina), como método independiente del cultivo, para realizar un análisis de las comunidades bacterianas y fúngicas presentes. Con el aislamiento de bacterias se observó la abundancia de bacterias Gram-negativas, entre las que se identificó al género Klebsiella y la especie Pantoea agglomerans. Entre los hongos aislados, por otro lado, se determinó la presencia de diferentes géneros y especies que en algunos casos no fueron detectados por metabarcoding y en particular se observó, únicamente en cerezas secas, la contaminación con Aspergillus niger, para el que se demostró la producción de OTA (105.03±16.36 µg/kg de medio) por HPLC. Por su parte, con metabarcoding se observaron algunas coincidencias como la presencia de Klebsiella y P. agglomerans entre las bacterias representadas con mayor abundancia, y la contaminación con A. niger en cerezas secas. Esta técnica, sin embargo, permitió realizar un análisis más profundo de la diversidad microbiana presente y evidenciar la diferencia en las poblaciones de cerezas frescas y secas. Entre las unidades taxonómicas operacionales (OTUs) bacterianas, los phyla Proteobacteria y Firmicutes fueron en general los dominantes, con la diferencia de que en cerezas secas los Firmicutes se observaron en una proporción más alta que en frescas por la presencia del género Weissella. Entre las OTUs fúngicas, los phyla Ascomycota y Basidiomycota fueron los dominantes, con mayor proporción de Basidiomycota en cerezas frescas que en secas, en las que se observó además una proporción más alta del género Aspergillus. Adicionalmente, en los dos puntos del procesamiento se determinó la abundancia de levaduras y se detectaron también, por otro lado, muchos géneros y especies de bacterias y hongos filamentosos que no se hallaron por aislamiento, con lo que se demostró una vez más la importancia del uso de métodos dependientes e independientes del cultivo en conjunto para realizar una mejor caracterización de las comunidades microbianas en cerezas de café y su procesamiento.