Regulación dual de la NADPH oxidasa por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en cultivo primario de hepatocitos de ratón Público Deposited
El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y su receptor c-Met protegen contra el daño celular provocado por el estrés oxidante mediante la inducción de proteínas antiapoptóticas y antioxidantes. Nrf2 es un factor de transcripción que regula positivamente la expresión de genes antioxidantes en el hígado, sin embargo, ahora se sabe que las especies reactivas de oxigeno (ERO) a niveles basales son necesarias para la activación de vías de señalización. Datos previos de nuestro grupo de investigación revelan que los hepatocitos de ratón con eliminación condicional de c-Met muestran un incremento en la activación de la NADPH oxidasa y la sobreexpresión de algunos de sus subunidades como Nox4, Nox2, p22 y p67. El objetivo de este trabajo fue identificar el mecanismo de regulación de la NADPH oxidasa ejercida por el HGF/c-Met y la inducción de la activación de Nrf2 por un mecanismo dependiente de este complejo enzimático. Los cultivos primarios de hepatocitos se aislaron usando el método de perfusión en dos pasos con colagenasa, se usaron ratones macho de la cepa CD1, las células se pre-trataron o no con 50 ng/ml de HGF. Los datos obtenidos muestran que HGF indujo un incremento en la actividad de la NADPH oxidasa y en la producción de ERO en tiempos tempranos (1-30 min) pero una disminución en tiempos más largos incluso por debajo de los niveles normales con respecto a las células no tratadas. El incremento temprano en el contenido de las ERO se relacionó con la activación de Nrf2 la cual fue analizada por medio de un ensayo de retardo de la movilidad electroforética (EMSA) y por microscopia confocal. Para verificar la activación de Nrf2 llevada a cabo por el HGF, se analizó la expresión de sus principales proteínas blanco SOD, -GCS y NQO1, donde se encontró que estas enzimas se incrementaron 2, 2.8 y 3 veces respectivamente con respecto a las células no tratadas. Para confirmar que el HGF tenía un efecto protector en los hepatocitos, se evaluó la viabilidad celular por medio de un estudio de tinción celular con cristal violeta. Debido a que HGF induce la disminución en la actividad de la NADPH oxidasa en tiempos más largos, decidimos caracterizar la expresión de ARNm y de la proteína de sus subunidades por medio de qRT-PCR e Inmunoblot respectivamente, los datos muestran que HGF induce una desregulación en Nox2, Nox4, p47 y p22. Finalmente, decidimos explorar la posibilidad de que c-Met estuviera interactuando con la NADPH oxidasa por medio de una de sus subunidades ancladas a la membrana esto se analizó con una inmunoprecipitación, los datos muestran una interacción entre c-Met y p22 la cual disminuye después de 30 min de tratamiento con HGF, este dato fue comprobado por un ensayo de entrecruzamiento. En conclusión nuestros datos muestran que HGF ejerce una regulación dual sobre la NADPH oxidasa, activándola en tiempos cortos como respuesta de sobrevivencia mediada por Nrf2 y disminuye su expresión en tiempos más largos quizá para evitar el uso de ésta oxidasa por citocinas citotóxicas.
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