Expresión e identificación de las proteínas Desert Hedgehog (DHH) silvestres y mutantes (L162P y ΔG1086) en diferentes sistemas in vitro - Castro Reyes, Josué Joram (Universidad Autónoma Metropolitana, 2011)
No todas las alteraciones en la diferenciación sexual se pueden atribuir al gen SRY del cromosoma sexual Y. Se ha propuesto que la disgenesia gonadal (DG), trastorno del desarrollo embrionario que impide la maduración completa del tejido gonadal en testículo, podría estar determinada por genes autosómicos que intervienen en el desarrollo del mismo. Estudios con ratones machos que no expresan (knock out) el gen Desert Hedgehog (Dhh) señalan que no hay desarrollo testicular y que están totalmente feminizados. Por otra parte, nuestro grupo de investigación reportó tres pacientes con disgenesia gonadal pura 46XY (DGP, 46XY) con mutaciones puntuales en el gen DHH, una de las cuales da lugar a un cambio de un aminoácido (p.L162P) en el fragmento amino terminal y otra con la eliminación de un nucleótido (1086ΔG) que recorre el marco de lectura y genera un codón de paro prematuro. El objetivo de nuestro estudio fue producir y caracterizar las proteínas DHH silvestre y mutantes en diferentes sistemas, con la finalidad de estudiar su posible participación en la DG. Los métodos incluyeron las construcciones moleculares en plásmidos circulares, así como la mutagenésis sitio-dirigida, secuenciación de las construcciones y la síntesis de las proteínas in vitro e in vivo. En la síntesis in vitro de la proteína DHH mutante (p.L162P) se observó disminución de la señal por medio de la hibridación tipo Western blot, con respecto a la proteína silvestre, mientras que la proteína mutada en el fragmento carboxilo terminal ΔG 1086 (p.L362del) no fue identificada con anticuerpos específicos para esta región. Cuando se analizaron por Western blot las proteínas DHH mutantes obtenidas por síntesis en el modelo HEK 293, se observaron diferencias de tamaño con respecto a la proteína silvestre, ya que la proteína mutante 1086ΔG (p.L362del) se localizó aproximadamente 3KDa abajo del peso de la silvestre, así como en menor cantidad. La proteína mutante (p.L162P) no pudo ser identificada con anticuerpos específicos del fragmento amino utilizados en este sistema. Nosotros proponemos que las mutaciones p.L162P y ∆G1086 (p.L362del) podrían ser la causa de una deficiencia en cantidad de la proteína DHH, lo cual probablemente sea uno de los posibles factores etiológicos de la disgenesia gonadal completa 46, XY.