Caracterización fisiológica de una cepa silvestre de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. y su mutante resistente a 2-desoxiglucosa - Rodríguez Gómez, Divanery (Universidad Autónoma Metropolitana, 2009)
Los hongos entomopatógenos permiten el control de los insectos que son plagas de cultivos de importancia económica, así como de insectos vectores de enfermedades de salud pública en humanos y animales de cría, de una manera ecológica, segura y económicamente viable. El potencial patógeno de estos hongos esta dado por un conjunto de factores, entre los que se encuentra la velocidad de germinación, la producción de enzimas hidrolíticas degradadoras de la cutícula de los insectos, la velocidad de crecimiento y la producción de toxinas en el hemocele, entre otros. En este trabajo se evaluaron los fenotipos presentados por dos cepas de Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales), una cepa silvestre y la cepa mutante derivada de ésta, resistente al compuesto tóxico 2-desoxiglucosa. Se realizaron cultivos en cajas de Petri para evaluar las diferencias en la germinación, el crecimiento y la esporulación. También, se realizaron cultivos en medio sólido para estudiar las diferencias en la respirometría y en la producción de enzimas proteasas y hexosaminidasas. Finalmente, se evaluó la acción letal de ambas cepas sobre cultivos de larvas y adultos del coleóptero Tenebrio molitor. Se observó que en condiciones de cultivo en medio sólido, las dos cepas presentaron un patrón respiratorio con dos fases bien definidas en todos los medios de cultivo estudiados: una de aumento exponencial y otra, de decaimiento exponencial, cada una con sus tasas específicas de respiración. La transición entre las dos fases fue abrupta y en el medio que contenía cutícula de chapulín, coincidió con el pico de la producción de proteasas (~50 h), además, la producción de hexosaminidasas se observó en una etapa posterior (~70 h) durante la fase final de su crecimiento. Por otra parte, las dos cepas presentaron diferencias respiratorias importantes, como fue la mayor tasa residual de respiración de la cepa mutante (15 a 33%) con respecto a la silvestre en los medios que contenían fragmentos de exoesqueletos de chapulín y salvado de trigo. Además, la cepa mutante presentó dificultad en el uso de las fuentes nutricionales como la glucosa, la quitina coloidal y el sulfato de amonio, lo cual se evidenció por valores de tasa respiratoria en el punto de transición, rXa, 38 a 56% menores, comparados con la cepa silvestre. Asimismo, la resistencia a la 2-desoxiglucosa conferida por la mutación aquí estudiada, pareció estar ligada a una capacidad disminuida del uso de la glucosa, alteró la producción y/o excreción de las enzimas quitinolíticas pero no la actividad proteolítica. En el medio con quitina coloidal, glucosa y nitrato de sodio, la cepa mutante mostró el doble del rendimiento enzima: biomasa que en el medio con quitina coloidal, y contrario al comportamiento de la cepa silvestre. Esta observación está de acuerdo con la acción pleiotrópica de este tipo de mutaciones. A pesar de dichas diferencias fenotípicas, la virulencia de las dos cepas fue prácticamente la misma, tanto con larvas como adultos de Tenebrio molitor. En el estudio de las secuencias de proteínas de los extractos de B. bassiana crecidas en medio sólido sobre cutícula de chapulín, se encontró una proteína tirosina fosfatasa no reportada en las bases de datos para este hongo, además de la expresión en CMS de las enzimas proteolíticas y quitinolíticas ya reportadas para este HE, pero en condiciones de cultivos sumergidos. En cuanto al estudio comparativo de virulencia sobre larvas y adultos de T. molitor, las primeras resultaron mucho más resistentes que los adultos y el medio de dextrosa Sabouraud fue más efectivo como productor de esporas infectivas que los otros medios más complejos, que contenían como fuentes de carbono y nitrógeno quitina coloidal, cutícula de chapulín y salvado de trigo. En conclusión: se propone que el estudio de la fisiología de la respiración, ligada a la síntesis de enzimas proteasas, durante la infección de B. bassiana puede ser un indicador de los cambios metabólicos y enzimáticos que influyen sobre su virulencia. Además, podría ser una metodología auxiliar para la selección y producción de estos organismos útiles para el control biológico.; Entomopathogenic fungi allow in a green, safe and economically viable way, the control of the insects that are pests of crops with economical importance, as well as insects that are vectors of public health diseases in humans and livestock. The pathogenic potential of these fungi is given by a number of factors, such as the rate of germination, production of cuticle degrading enzymes, the growth rate and toxins production in the hemocele, among others. In this work, we assessed the phenotypes presented by two strains of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales), a mutant type strain resistant to the toxic compound 2- deoxyglucose and the wild type strain from which it derived. Cultures were performed in Petri dishes to assess the differences in germination, growth and sporulation. In addition, solid state cultures were conducted in order to analyze the differences in respirometry and production of proteases and hexosaminidases. Finally, we evaluated the lethal action of both strains on larvae and adults of the beetle Tenebrio molitor. It was observed from the solid state cultures that both strains showed a respiratory pattern with two well-defined phases in all the culture media studied: an exponential increase followed by an exponential decay, each one with its specific breathing rate. The transition between the two phases was abrupt, corresponded to the time ta, which coincided with the peak of proteases production (~ 50 h) in the medium that contained grasshopper exoskeletons; as far as the hexosaminidases production is concerned, this was observed at a later stage (~ 70 h) during the final phase of its growth. Moreover, both strains showed respiratory significant differences, for instance, the mutant strain showed higher residual respiration rate, r’Xe , in the media containing fragments of grasshopper exoskeletons and wheat bran (15 to 33%) than the wild type strain. Furthermore, the mutant type strain had difficulty using simple sources as glucose In addition, the resistance to 2-deoxyglucose seemed to be linked to a diminished capacity in the use of glucose, and an alteration of the production and/or excretion of the chitinolytic enzymes, but the proteolytic activity was not altered. For the mutant type strain, in the medium with colloidal chitin, glucose and sodium nitrate, the yield enzyme: biomass was twice of that observed in the medium that contained colloidal chitin, having an opposite behavior to the observed in the wild type strain. This analysis is consistent with the pleiotropic action of this kind of mutations. Despite these phenotypic differences, the virulence of both strains was virtually the same either on larvae or adults of Tenebrio molitor. The study of the protein sequences in the extracts of B. bassiana grown on solid state culture on the grasshopper exoskeletons, showed the presence of a tyrosine phosphatase, which has not been reported in the databases for this fungus, as well as the expression in solid state conditions of chitinolytic and proteolytic enzymes, that have already been reported for this entomopathongenic fungi but in submerged cultures. For the comparative study of virulence on larvae and adults of T. molitor, larvae showed to be much more resistant than adults; furthermore, Sabouraud dextrose medium was more effective as a producer of infective spores than others more complex media containing as carbon and nitrogen sources colloidal chitin, grasshoppers cuticle and wheat bran. In conclusion, it is proposed that the study of the physiology of respiration, linked to the synthesis of protease enzymes, during the infection of B. bassiana may be an indicator of metabolic and enzymatic changes that influence on its virulence. In addition, this study could be considered as an auxiliary method for the selection and production of these useful organisms for biological control.