Actividad anti-inflamatoria y anti-ulcerogénica de hojas de planta silvestre y tejidos desdiferenciados de Tilia americana variedad mexicana (Schltd) Hardin Público Deposited

En la medicina tradicional mexicana se utilizan las brácteas de Tilia americana variedad mexicana (Schltd) Hardin, conocida en México como tila, principalmente para el tratamiento de trastornos nerviosos. Investigaciones recientes han permitido corroborar sus efectos antidepresivos, ansiolíticos, analgésicos y sedantes, los cuales son atribuidos a los compuestos tilirósido, quercetina, rutina, canferol, isoquercitrina, luteolina y apigenina; también se han identificado taninos, cumarinas, ácidos fenólicos y polifenoles. Infusiones de las hojas e inflorescencias del árbol también son utilizadas tradicionalmente, en el tratamiento de afecciones que conllevan a un proceso inflamatorio y enfermedades gastrointestinales; estos efectos farmacológicos no han sido explorados científicamente. Considerando que la SEMARNAT ha catalogado esta especie como en peligro de extinción con base a la NOM-059-SEMARNAT-2010, debido a la sobreexplotación de su madera, flores y hojas, ha sido importante buscar estrategias biotecnológicas que permitan el rescate de T. americana var. mexicana. Para contar con material vegetal de calidad para continuar con estudios biotecnológicos, fitoquímicos y farmacológicos conducentes a la elaboración de un fitofármaco, se ha abordado el enraizamiento de estacas y micropropagación empleando explantes de yemas axilares empleando el medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) complementado con 0.25 mg/L de ácido naftalenacético (ANA) en combinación con 1.0 mg/L de bencilaminopurina (BA) se obtuvo 7.75 brotes/explante a los 60 días de cultivo. Los brotes regenerados fueron enraizados con 5.0 mg/L de ácido indol-3-butírico (AIB) y posteriomente se aclimataron. En este trabajo de investigación, se obtuvieron plantas a partir de esquejes enraizados con AIB en condiciones de invernadero, las cuales se aclimataron en maceta a las condiciones ambientales en Xochitepec, Morelos. Así mismo, se establecieron cultivos in vitro de brotes múltiples y callos a partir de explantes de yemas apicales y axilares de T. americana var. mexicana. Las yemas apicales (75%) generaron principalmente brotes (2-3 brotes/explante) en el medio de cultivo MS suplementado con 2.0 mg/L de BA en combinación con 0.25 mg/L de ANA. La callogénesis se presentó en ambos tipos de yemas en los tratamientos (0.005-0.02 mg/L) constituidos por tidiazurón (N-fenil-N ´- 1,2,3-thidiazol-5-ilurea, TDZ) en combinación con 0.1 mg/L de AIB. En el análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de los extractos metanólicos de hojas de la planta silvestre y de biomasa de callo de yemas apicales, se detectó la presencia de los compuestos con actividad ansiólitica 3-b-D-glucósido de quercetina y tilirósido ya reportados; además de escopoletina, compuesto conocido por sus propiedades antiinflamatorias. Con base al uso tradicional de los tejidos aéreos del árbol de tilia para tratar problemas gastrointestinales y la presencia de escopoletina en las hojas de la planta silvestre y de biomasa de callo, los extractos metanólicos de ambos tejidos se evaluaron en modelos murinos de inflamación y úlceras. Ambos extractos mostraron actividad antiinflamatoria de forma dosis-dependiente en el modelo de edema auricular inducido con 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA), con una dosis efectiva media (DE 50) de 0.38 y 1.73 mg/oreja para los extractos de hojas y callo, respectivamente. Asimismo, en el modelo de úlceras gástricas inducidas con etanol, los extractos metanólicos de hojas de la planta silvestre y de biomasa de callo presentaron un efecto gastroprotector de 35 y 29%, respectivamente. Con base a estos resultados, el extracto metanólico de biomasa de callo se fracccionó en columna abierta utilizando un sistema de elución diclorometano:metanol. Con base a su perfil químico observado en cromatografía en capa fina, las fracciones F6, F15 y F23 integradas por compuestos de baja, mediana y alta polaridad, se evaluaron en los modelos biológicos antes mencionados. La fracción F15, constituida por escopoletina y esculina entre otras cumarinas, fue la más activa (p < 0.05) en ambos modelos murinos, con una inhibición del 27% del edema auricular y con un efecto gastroprotector del 55%. Escopoletina y esculina se han aislado de varias especies de plantas, y en estudios científicos se han reportado sus propiedades antiinflamatorias; así como un efecto gastroprotector para escopoletina. Debido a estos hallazgos, es importante establecer el cultivo de células en suspensión de Tilia americana var. mexicana en el medio de cultivo MS y caracterizar el crecimiento y producción de compuestos activos, así como evaluar sus estrategias de estimulación.

In Mexican traditional medicine, the inflorescences of Tilia americana variedad mexicana (Schltd) Hardin, known in Mexico as tila, are mainly used for the treatment of nervous disorders. Recent research has allowed us to corroborate its antidepressant, anxiolytic, analgesic and sedative effects, which are attributed to the compounds tiliroside, quercetin, rutin, kaempferol, isoquercitrin, luteolin and apigenin; tannins, coumarins, phenolic acids and polyphenols have also been identified. Infusions from leaves and inflorescences are also traditionally used in the treatment of conditions that lead to an inflammatory process and gastrointestinal disorders; these pharmacological effects have not been scientifically explored. Considering that SEMARNAT has cataloged this especies as endangered based on NOM-059-SEMARNAT-2010, due to the overexploitation of its woods, flowers and leaves, it has been important to look for biotechnological strategies that allow the rescue of T. americana var. mexicana. In order to ensure the continuous quality in plant material for carrying biotechnological, phytochemical and pharmacological studies leading to the development of a phytopharmaceutical product, the use of cutting rooting and micropropagation by seedling bud explants, in culture medium of Murashige and Skoog (MS) supplemented with 0.25 mg/L of naphthalenacetic acid (NAA) in combination with 1.0 mg/L of 6-benzyl aminopurine (BA), 7.75 shoots/explant were obtained at 60 days of culture. The regenerated shoots were rooted with 5.0 mg/L of indole-3-butyric acid (IBA) and subsequently acclimatized. In this research work, plants were obtained from cuttings rooted with IBA under greenhouse conditions, which were acclimatized in pot to the environmental conditions in Xochitepec, Morelos. Thus, in vitro cultures of multiple shoots and callus were established from explants of apical and axillary buds of T. americana var. mexicana. The apical buds (75%) generated mainly shoot (2-3 shoots per explant) in culture medium MS, supplemented with 2.0 mg/L of BA in combination with 0.25 mg/L NAA. Callogenesis occurred in both types of buds in treatments (0.005-0.02 mg/L) consisting of thidiazuron (TDZ) in combination with 0.1 mg/L of IBA. In the analysis by high performance liquid chromatography (HPLC) for methanolic extracts of wild plant leaves and callus biomass from apical buds, the presence of compounds associated to anxiolytic activity like quercetin 3-b- D-glucoside and tiliroside, was detected; besides, scopoletin a compound known for its anti- inflammatory properties. Based on the traditional use of the aerial tissues of the tilia tree to treat gastrointestinal problems and the presence of scopoletin in the leaves of the wild plant and callus biomass, the methanolic extracts of both tissues were evaluated in murine models of inflammation and ulcers. Both extracts showed a dose-dependent anti-inflammatory activity in the model of ear edema induced with 12-O- tetradecanoylforbol-13-acetate (TPA), with an average effective dose (ED50) of 0.38 and 1.73 mg/ear for leaf and callus extracts, respectively. Likewise, in the model of gastric ulcers induced with ethanol, the methanolic extracts of leaves from the wild plant and callus biomass had a gastroprotective effect of 35% and 29%, respectively. Based on the results, methanolic extract from the callus biomass was fractionated in an open column using a dichloromethane:methanol elution systems. Considering their chemical profile in thin layer chromatography, fractions F6, F15 and F23 composed of low, medium, and high polarity compounds, were evaluated in the biological models mentioned before. The F15 fraction, consisting of scopoletin and esculin among other coumarins, was the most active (p < 0.005) in both murine models, with a 27% inhibition for ear´s edema and a 55% gastroprotective effect. Scopoletin and sculin have been isolated from several species of plants, and their anti-inflammatory properties have been reported in scientific studies; as well as a gastroprotective effect for scopoletin. Due to these findings, it is important to establish the suspension cell culture of Tilia americana var. mexicana in MS culture medium and characterize the growth and production of active compounds, as well as evaluate their stimulation strategies.

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