Diseño y evaluación de un medio de cultivo tipo industrial para la producción heteróloga de un péptido con actividad antimicr0biana en Streptomyces lividans TK24 - Calderón de la Sancha, Fernanda Jocely (Universidad Autónoma Metropolitana, 2017)
La producción heteróloga de péptidos antimicrobianos (AMPs) actualmente, es una herramienta muy atractiva en procesos industriales; los AMPs son una alternativa prometedora por poseer principalmente actividad antimicrobiana en una amplia gama de microorganismos. Sin embargo, a pesar de este amplio espectro de acción, el cual es debido a su mecanismo de acción, estos no afectan a las células eucarióticas haciéndolos biotecnológicamente atractivos para su producción. En este sentido, los sistemas de expresión heteróloga son utilizados frecuentemente para la producción de moléculas de importancia industrial debido a que pueden alcanzar mayores niveles de producción que la fuente original, sin embargo, los rendimientos de las proteínas recombinantes varían dependiendo de la proteína específica y del sistema de expresión seleccionado. Actualmente, se ha logrado diseñar un sistema de expresión de un AMP catiónico en S. lividans TK24, basado principalmente en el uso de un péptido señal (vsi) el cual, mostró ser eficaz para la secreción de grandes cantidades de AMPs. El péptido de interés (PepB15); cuya secuencia es Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-LysLys-Leu-Ala-Ala no es tóxico para plantas y animales, tiene una actividad de amplio espectro contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como hongos. El interés principal sobre PepB15 es implementarlo contra fitopatógenos en el sector agrícola.En el presente trabajo se diseñó un medio de cultivo tipo industrial que cumpliera con los factores nutricionales requeridos por la cepa modelo de estudio S. lividans TK24 (cepa parental y cepa transformante) en la etapa de producción. El medio de producción UP (DGA) fue el medio probado en la etapa de producción de PepB15 con la cepa transformante, los resultados obtenidos muestran que es un medio que induce 10 la producción de PepB15 mostrando incluso mayor actividad antimicrobiana que con el medio R2 (comparación de halos de inhibición) tomado como control positivo. Como control negativo se cultivó a la cepa parental (S. lividans TK24). Para la cepa transformante, se evaluó el efecto de las fuentes de carbono y nitrógeno para la biosíntesis de PepB15 en S. lividans TK24-PepB15. Modificar la fuente de carbono no resulta favorable para la producción del péptido ya que se presenta menor actividad si es modificada por glucosa o sacarosa, por otro lado, se observa mayor actividad antimicrobiana al cambiar la fuente de nitrógeno original (triptona) por extracto de levadura grado industrial. Se realizaron pruebas piloto en biorreactores de 14 L para la producción de PepB15 utilizando medio UP como medio de producción y empleando las siguientes condiciones: aireación 1vvm, agitación de 150 rpm, 30 °C, pH constante de 7 ± 0.2. Bajo estas condiciones se comprobó actividad antimicrobiana contra B. subtilis.Se determinó la razón por la cual la producción de PepB15 se detiene y disminuye a determinado tiempo. Con base en los resultados obtenidos al realizar cultivos por lote alimentado, se determinó que la producción de PepB15 disminuye debido a que la cepa hospedera resultó ser sensible a determinadas concentraciones de este péptido presente en el medio extracelular. Por otro lado, con la cepa parental (S. lividans TK24) se obtuvieron resultados totalmente inesperados al realizar bioensayos de actividad, donde se observó actividad antimicrobiana. Para ello, se evaluó el efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la expresión de la molécula con actividad antimicrobiana; modificar tanto la fuente de carbono como la fuente de nitrógeno desfavorece la biosíntesis de esta molécula que de forma natural es secretada al medio extracelular utilizando el medio UP sin ninguna modificación.