Diseño de un medio de cultivo de bajo costo para el crecimiento de bacterias ácido lácticas empleadas como potencial agente de control biológico de la producción de Ocratoxina A Público Deposited
La Ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario tóxico, teratogénico y posiblemente carcinógeno producido por especies de hongos filamentosos superiores de los géneros Aspergillusy Penicillium. Contamina alimentos de consumohumano, como el café que se presume como la bebida más popular del mundo después del agua. La subsistencia de 100 millones de personas en el mundo depende del café. Una estrategia para reducir la presencia de OTA en los granos de café es el control biológico mediante el uso de bacterias ácidolácticas(BAL), pues se ha demostrado que estas bacterias ejercen un efecto inhibitorio en los hongos productores de OTA; sin embargo, dichas bacterias requieren medios ricos ennutrientes para poder crecer. Una consecuencia de lo anterior es que el medio de cultivo podría resultar costoso,por lo que en el presente trabajo se desarrollaron metodologías para diseñar un medio de cultivo de bajo costo para la obtención de biomasa de BAL y su posterior aplicación como agente de biocontrol de hongos productores de OTA. En la primera etapa experimental, se hizo un análisisde los componentes del medio MRS (De Man,Rogosa, Sharpe), especialmente de las potenciales fuentes de nitrógeno (N) alternas provenientes de cereales y granos. El extracto de carne (EC) y la peptona de carne (PC) resultaron ser los componentes más costosos (8000 $/kg) del medio MRS y las fuentesde N alternas fueron más económicas (más de un 90 % menos del costo del EC y la PC). Posteriormente se analizó la concentración de Npresente en el medio de cultivo MRS y en las fuentes de N alternas para diseñar el medio de cultivo con la finalidad de que suplieran la falta de N por la eliminación del EC y la PC.La selección de la fuente de N alterna se realizó mediante el conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL) de Lactobacillus plantarum presentes en cultivos en medios formulados con dichas fuentes. De entre todas las fuentes de N estudiadas el extracto de germen de malta (EGM), residuo de la industria cervecera, resultó ser la mejor opción pues se obtuvieron concentraciones celulares cercanas a las obtenidas con el medio de referencia MRS (3x109UFC/mL), el EGM se empleó como fuente de N para los siguientes ensayos.En una segunda etapa se seleccionaronlasvariablesimportantespara el diseño del medio de cultivo mediante un diseño experimental del tipo Plackett-Burman (PB). Las variables de respuesta fueron la concentración de biomasay su productividad. Se realizaron cinéticas de crecimientoylos datos experimentalesde concentración de biomasase ajustaronal modelo Logístico.Se observaron diferencias entre los tratamientos evaluados, con algunos se obtuvo una mejor respuesta (concentración de biomasa y productividadde biomasa) que con otros tratamientos.Se demostróque el EGM es una fuente de N alterna competitiva que puede suplir alEC y la PC.Por otro lado, los factores que ejercenun mayor efecto sobre la biomasa y la productividadde biomasafueron la concentración de acetato de sodio y de sulfato de magnesio por lo que dichos factores se seleccionaron para la optimización de la composición del medio de cultivo. En la tercera etapa se buscó optimizar la composición del medio de cultivo para mejorar la concentración de biomasa y la productividad de biomasa de L. plantarummediante un diseño factorial central compuesto (DFCC) acoplado a la metodología de superficie de respuesta (MSR) empleando al acetato de sodio y sulfato de magnesio como factores del diseño experimental. Se realizaron cinéticas de crecimiento y formación de ácido láctico (AL),los datos experimentales seajustarona modelos matemáticos;no se encontraron diferencias entre los tratamientos, pero se obtuvieron valores similares a los obtenidos con el medio MRS (4 g/L de biomasa y 15g/Lde AL,respectivamente). Se estudió a fondo el efecto de los factores sobre la concentración de biomasa y productividad mediante el diseño experimental. La metodología de superficie de respuesta mostró cuatro niveles de los factores donde la respuesta (concentración de biomasa y productividad de biomasa) era similar y elevada por lo que se validó el modelo experimentalmente probando los niveles encontrados. Se confirmó que en dichos niveles la formación de biomasa y la productividad era la máxima resultando en un medio de cultivo mucho más económico que el medio de referencia (MRS) y teniendo la conveniencia de elegir entrelasdiferentes concentraciones estudiadas de los factores. Además, la viabilidad de las células se comprobó mediante conteos celulares en placas, en el medio formulado con EGM sealcanzaron valores de hasta 5x109UFC/mL Finalmente, se comprobó el efecto inhibitoriode L. plantarumcrecido en el medio optimizado sobre A. carbonarius mediante la técnica de cultivo enmedios envenenados empleando por un lado el extracto libre de células (ELC) de 24 y 96 horas de cultivo y por otro a las células. El mayor efecto inhibitorio se manifestó en cultivos con ELC de 96 h, con un 50 %de inhibiciónde crecimiento radial del hongo.Los resultados obtenidos en el presente trabajo demuestran que un medio de cultivo formulado con EGM es una alternativa económica y muy competitivacon el medio de cultivo MRS dándole además un valor agregado a un subproducto de la industria cervecera; no obstante, es necesario investigar más a fondo los productos de fermentación de L. plantarumen un tiempo de cultivo de hasta 96 hpara mejorar su capacidad inhibitoria en hongos filamentosos.
Ochratoxin A (OTA) is a toxic, teratogenic and possibly carcinogenic secondary metabolite produced by species of higher filamentous fungi of the Aspergillusand Penicilliumgenera. It contaminates food for human consumption, such as coffee that is presumed tobe the most popular beverage in the world after water. The livelihood of 100 million people in the world depends on coffee. A strategy to reduce the presence of OTA in coffee beans is biological control usinglactic acid bacteria (LAB). As it has been shown that these bacteria exert an inhibitory effect on OTA-producing fungi; However, these bacteria require nutrient rich media to grow.A consequence of the above is that the culture medium could beexpensive. It is why in the present work different methodologies were developed to design a low-costculture medium for the obtaining of LAB biomassand its later application like agent of biocontrol of fungi producing OTA.In the first experimental stage, an analysis was made of the costof thecomponents of MRS medium (De Man, Rogosa, Sharpe), specially cereals and grains aspotential alternative nitrogen source (N) from cereals and grains. Meat extract (EC) and meat peptone (PC) are the most expensive components ($ 8 000 / Kg) of MRS broth, by the other side, alternative sources of N were low cost(more than 90% less than EC and PC). Subsequently, the Nitrogen concentration present in the MRS culture medium and in the alternate sources of N were analyzed to design the culture medium that would replace the lack of N due to the elimination of EC and PC. The selection of the alternate N source was made by counting Colony Forming Units (CFU/mL) of Lactobacillus plantarumpresent in cultures in media formulated with alternate N source. Among all the sources of N studied, the malt germ extract (EGM), a residue of the beer industry, proved to be the best option because cell concentration attained were close to thatobtained with the MRS reference medium (3x109CFU / mL); EGMwas used for the following tests.In second stage, the variables important for the design of the culture medium were selected through an experimental Plackett-Burman (PB) design. The response variables were the concentration biomass and itsproductivity. Growth kinetics were performed, the experimental biomass concentration data were adjusted to the Logistic model. Differences were observed between the treatments evaluated, insome cases a better response (biomass concentration and its productivity) was obtained than with other treatmentsit was demonstratedthat the EGM is a source of alternating N very competitive with the EC and the PC. Otherwise, the factors that exert a greater effect on biomass and productivity were the concentration ofsodium acetate and magnesium sulfate, so these factors were selected for the optimization of the composition of the culture medium. In the third stage, we sought to optimize the composition of the culture medium to improve the biomass concentration and biomass productivity of L. plantarumthrough a composite central factorial design (DFCC)coupled to response surface. The response surface methodology showed four levels of the factors where the response (biomass concentration and biomass productivity) washigh and similar, so the model was validated experimentally by testing the levels found. It was confirmed that at these levels the biomass formation and productivity were closethe maximum resulting in a much more economical culture medium than the reference medium (MRS) and having the convenience of choosing between the different concentrations studied of the factors. In addition, the viability of the cells grown was checked by cell count in plates,in the medium formulatedwith EGM reached values of up to 5x109CFU / mL.Finally, the inhibitory effect of L. plantarum grown in the optimized medium on A. carbonarius was checked by means of thepoisoned media culture technique using the cell-free extract (ELC) of 24 and 96 hours of culture and on the other hand to the cells. The greatest inhibitory effect was manifested in cultures with 96 h ELC, with 50% of inhibitionof radial growth of the fungus. The results obtained in the present work demonstrate that a culture medium formulated with EGM is an economical and competitive alternative with the MRS culture medium, also giving added value to a by-product of the beer industry; however, it is necessary to further investigate the fermentation products of L. plantarumin a cultivation time of up to 96 hto improve their inhibitorycapacity in filamentous fungi with EGM.
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