Cancer is a complex and diverse disease that poses a significant global concern. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most prevalent form of primary liver cancer and one of the leading causes of cancer-related deaths worldwide. On the other hand, high fructose consumption is increasing mainly in young populations. Due to its metabolism, several studies have explored the tumor-promoting role of fructose in various types of cancer, including HCC. These studies indicate a relationship between fructose consumption and the risk of both HCC initiation and progression. Furthermore, emerging data suggest that dietary fructose may affect gene and microRNAs (miRNAs/miRs) expression in the pathogenesis of HCC. miRNA expression profiling revealed the dysregulation of miR-23a-27a-24-2 cluster under fructose intake. MicroRNAs are small non-coding RNAs that can act either as oncogenic RNAs or tumor suppressors in cancer. It has been reported that the miR23a-27a-24-2 cluster critically modulates HCC biology through several processes. One mRNA target of these miRNAs is p53, a well-known tumor suppressor protein that plays a major role in safeguarding genomic stability by regulating DNA damage and other mechanisms. In HCC, p53 mutations can lead to a more aggressive phenotype. The aim of this study was to characterize chromosomal instability and aggressiveness parameters in human hepatocellular carcinoma-derived cells under fructose treatment. To evaluate the effects of fructose, an in vitro model was employed using different human hepatocellular carcinoma cell lines with varying degrees of aggressiveness. HepG2, Hep3B, Huh-7, and PLC/PRF/5 cell lines were used. For the experiments, fructose (Fru) at 1 mM was applied at different time points to assess chromosomal instability and drug resistance. In vitro assays under Fru [1 mM] treatment showed a decrease in p53 expression at different time points in HepG2, Huh-7, and PLC/PRF/5. Chromosomal instability was evaluated by micronucleus (MN) formation, with a higher percentage of MNs observed in cell lines with null p53, such as Hep3B, and in those with mutated p53, such as Huh-7. In addition, cotreatment with fructose and a chemotherapeutic agent, such as cisplatin (CDDP), reduced DNA damage in HepG2 and Hep3B cells. In addition, the strategy and mechanism for silencing and overexpressing the miR-23a-3p, miR-27a-3p, and miR-24-2-5 cluster were designed.
El cáncer de hígado representa un importante problema de salud a nivel global. En particular, el carcinoma hepatocelular (CHC) es la neoplasia hepática primaria más frecuente y la cuarta causa de mortalidad por cáncer a nivel mundial. La enfermedad hepática esteatósica asociada a disfunción metabólica (MASLD) está relacionada con el aumento de la incidencia y la aparición del CHC. En México, se estima que la prevalencia de la MASLD es de casi el 50% de la población. La MASLD puede progresar a esteatohepatitis asociada a disfunción metabólica (MASH), que puede evolucionar a CHC. La incidencia de MASH-CHC está en aumento debido principalmente a la influencia de la dieta occidental que se relaciona con el consumo de alimentos ultraprocesados, como los azúcares refinados con edulcorantes añadidos, como la fructosa. Este monosacárido constituye el jarabe de maíz de alto contenido en fructosa (JMAF), que se ha convertido en una de las formas de azúcar más utilizadas en la industria alimentaria y se emplea ampliamente en bebidas azucaradas. En 2021, más del 30 % de la población mundial consumía cantidades excesivas de bebidas azucaradas y en México la fuente principal de consumo de azúcar proviene de estas bebidas en todos los grupos de edad. La fructosa es un monosacárido altamente lipogénico que se metaboliza principalmente en el hígado; en exceso, puede inducir la expresión de genes lipogénicos clave y conducir a una lipogénesis aberrante, lo que puede provocar la aparición de enfermedades metabólicas como la MASLD. Además, la fructosa está relacionada con procesos inflamatorios y con la aparición y progresión del cáncer, en donde contribuye con una mayor proliferación celular, lo que genera tumores resistentes a fármacos y fenotipos más agresivos, con peor pronóstico. También conduce a la desregulación de microRNAs (miRNAs/miRs) que están ampliamente relacionados con la hepatocarcinogénesis y la progresión de CHC mediante la regulación negativa de genes blancos. Además de los genes lipogénicos, la fructosa desregula genes importantes para la proliferación celular y la agresividad, como p53, un gen supresor de tumores clave en el cáncer. Pregunta de investigación ¿Cómo influye la fructosa en los parámetros de inestabilidad cromosómica y agresividad del carcinoma hepatocelular humano, y cómo se asocia esto con cambios en p53 y el cluster miR-23a-3p, miR-27a-3p y miR-24-2-5? Hipótesis El tratamiento con fructosa inducirá inestabilidad cromosómica y mayor agresividad en líneas celulares derivadas de carcinoma hepatocelular humano, asociadas con una disminución de la expresión de p53 y alteraciones relacionadas con la expresión del cluster miR-23a-3p, miR-27a-3p y miR-24-2-5. Objetivos Objetivo general Caracterizar la inestabilidad cromosómica y los parámetros de agresividad en células derivadas del carcinoma hepatocelular humano bajo un tratamiento con fructosa, Objetivos específicos 1. Analizar el impacto de la fructosa en los parámetros de inestabilidad cromosómica. 2. Evaluar el impacto en la expresión de p53 como gen blanco del cluster miR23a-3p, miR-27a-3p y miR-24-2-5. 3. Diseñar la estrategia y el mecanismo para silenciar al cluster miR-23a-3p, miR27a-3p y miR-24-2-5 mediante CRISPR-Cas9 y sobreexpresar al cluster miR-23a3p, miR-27a-3p y miR-24-2-5. Materiales y Métodos Para evaluar los efectos de la fructosa se utilizó un modelo in vitro, utilizando como modelos diferentes líneas celulares derivadas de carcinoma hepatocelular humano de distintos grados de agresividad. Se utilizaron las células HepG2, Hep3B, Huh-7 y PLC/PRF/5 a las que se les suministró un tratamiento con fructosa (Fru) a una concentración de 1 mM durante distintos tiempos para observar la inestabilidad cromosómica y la resistencia a fármacos. Además, se diseñó la estrategia y el mecanismo para silenciar al cluster miR-23a-3p, miR-27a-3p y miR-24-2-5 mediante CRISPR-Cas9 y sobreexpresar al cluster miR-23a-3p, miR-27a-3p y miR-24-2-5. Resultados Las evaluaciones in vitro bajo un tratamiento con Fru [1mM] mostraron una disminución en los niveles de expresión de p53 a diferentes tiempos en HepG2, Huh-7 y PLC/PRF/5. La inestabilidad cromosómica se evaluó por la formación de micronúcleos (MN), en donde se observó un mayor porcentaje de MN en las líneas, celulares con p53 nulo, como Hep3B, y con p53 mutado, como Huh-7. Se observó que un tratamiento con fructosa y un agente quimioterapéutico como cisplatino (cisdiaminodicloro platino (II)) conduce a un menor daño al ADN en HepG2 y Hep3B. Por otro lado, con el antecedente de la desregulación del miR-23a-3p, miR-27a-3p y miR-24-2-5 en CHC y bajo un tratamiento con fructosa, se diseñó la estrategia y el mecanismo para silenciar al cluster de microRNAs y sobreexpresarlo en la línea celular HEK293FT. Conclusión Los resultados de los ensayos in vitro muestran la participación de la fructosa como un modulador en la disminución de la expresión de p53, que conduce a una progresión descontrolada del ciclo celular y la inestabilidad cromosómica. Éstas a su vez promueven la generación de micronúcleos y quimioresistencia generando fenotipos más agresivos. Además, se realizó el diseño del mecanismo de corte del cluster de microRNAs y la producción de pseudovirus con la sobreexpresión del cluster.
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